Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2002
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: Melek Özkan
Danışman: GÜLAY ÖZCENGİZ
Özet:Bu çalışmada, Clostridium thermocellum 27405 susundan L-laktat dehidrogenaz enzimini (LDH, EC. 1.1. 1.27) kodlayan gen Escherichia coli ' de ilk kez klonlanmış ve karakterize edilmiştir. Polimeraz zincir reaksiyonu sonucunda elde edilen 357'bp lik ürün, C. thermocellum Lambda Zap II faj gen kütüphanesini taramak için prob olarak kullanılmıştır. Pozitif klondan elde edilen plazmidin 2.5 kb'lık bir DNA parçası taşıdığı saptanmış ve sekans analizi sonucunda bu DNA parçasının 948 bp lik Idh genini içerdiği tespit edilmiştir. C. thermocellum LDH amino asid diziliminin Clostridium perfringens, Bacillus stearothermohilus, Thermus caldophilus, and Lactobacillus casei LDH ezimlerinin amino asid dizilimleriyle olan benzerliği sırasıyla % 57.1, %48.9, % 41.5, and % 47.1 olarak bulunmuştur. vıC. thermocellum' xm G+C kontentinin düşük olmasının kodon kullanımını etkilediği, sonu A ya da T ile biten kodonların daha fazla kullanıldığı belirlenmiştir.. Genin 5' bölgesinde tespit edilen ribozom bağlanma ve promotor bölgeleri diğer clostrial genlerle benzerlik göstermektedir. Klonlanan gen E. colfde başarıyla ifade edilmiştir. C. thermocellum LDH enziminin allosterik bir enzim olduğu ve fructose 1,6 diphosphate tarafından aktive edildiği saptanmıştır. Ayrıca genin E. coli'de lac promoted tarafından ifade edilebildiği ve IPTG tarafından gen ifadesinin arttığı tespit edilmiştir. Araştırmanın ikinci bölümünde, transformasyonu başarılmış endüstriyel bir C. thermocellum suşunun mevcut olmaması ve bilinen C. thermocellum suşlanmn etanol selektivitelerinin düşük olması sebebiyle doğadan termofilik, anaerobik. sellülolitik, etanol üreticileri izole edilmiş ve çeşitlilikleri saptanmıştır. Bilinen iki standard suş ve onüç yeni izole edilmiş suşlar sellüloz kullanımı, antibiyotik dirençliliği, koloni morfolojisi ve fermentasyon ürünleri açısından kıyaslanmalardır. 16SrRNA geni için düzenlenmiş primerler kullanılarak suşların C. thermocellum ile olan genetik yakınlıklarına bakılmıştır. Ayrıca suşların hidrogenaz ve fosfotransasetilaz/asetat kinaz enzim genleri arasındaki homoloji de yine PCR metodu kullanılarak karşılaştırılmıştır. Onüç sustan ikisi (7-10-1, 7-12-1) bu genlerin çoğu için C. thermocellum 'dan farklılık göstermiş olup bu suşların filogenetik olarak C. thermocellum" dan. çok farklı oldukları düşünülmektedir. Sellülolitik izolatların sellülozom sistemlerinin bir parçası olan sellüloz bağlanma proteinlerine karşılık gelen gen dizileri PCR yoluyla çoğaltılmıştır. 9 izolat için elde edilen amplikonların sekans analizleri sonucunda izolatlann sellüloz kullanma kapasiteleri ile sellüloz bağlanma proteinlerinin amino asit dizilimleri arasında doğrudan bir ilişki saptanamamıştır. Suşlara PEG elektroporasyon ile gen transferi yapılmaya çalışılmış, ancak transformasyonları mümkün olmamıştır. Transforme edilebilir bir termofilik. sellülolitik, etanol üreticisi izole etmek amacıyla "karışık kültür transformasyonu" adı verilen bir teknik geliştirilmiştir. Bu özellikleri taşıyan bakteriler doğada diğer bakterilere kıyasla son derece nadir bulunduğundan bu teknik kullanılarak kompetent bir sellüloz kullanıcısı elde edilememiş, ancak termofilik, kompetent, anaerobik bakteriler elde edilmiştir. Böyle bir susun transformasyonu sonucunda transfer vıı t:©KUM*NTAS¥©N ÜRİettiğimiz plasmid yapısal değişikliğe uğramıştır. Kıyaslanan restiriksiyon enzim bölgelerinden yalmzca dört tanesi değişiklik göstermezken diğer pek çok restriksiyon bölgesinin kaybolduğu ya da sonradan oluştuğu görülmüştür.