Extracellular recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2007
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: MEHMET ALİ ORMAN
Danışman: PINAR ÇALIK
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışmada, biyoproses işletim parametrelerinin Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretimi üzerine etkisi sistematik olarak incelenmiştir. Bu kapsamda, rekombinant insan büyüme hormonunun (rhGH) hücre dışı salgılanması ve üretim ortamından saflaştırılması için metabolik mühendislik tasarımı yapılmıştır. İnsan büyüme hormonun kromatografik yöntemlerle ayrılmasını sağlayan 6xhistidin dizinini ve saflaştırılmış hormonun bu amino asitlerden ayrılmasını sağlayan Faktör Xa proteaz enziminin tanıdığı amino asit dizinini kodlayan DNA hGH hormonun genine PCR yöntemi ile entegre edilmiş; ve oluşturulan pPICZ?A::hGH, P. pastoris kromozomunun AOX1 (alkol oksidaz 1 enzim geni) bölgesine entegre edilerek, metanol tarafından tetiklenen AOX1 promoteri kontrolünde hGH sentezlenmiştir. Dot-blot analiz yöntemi ile klonlanmış olan mikroorganizmalar arasından en uygun farklı iki fenotip, Mut+ ve Muts, seçilmiştir. Mut+ ve Muts ile methanol derişiminin rhGH üretimine tanımlı ve kompleks ortamlarda etkisi incelenmiştir. Kompleks ortamda (BMMY ortam), hacimce %2(h/h) metanol derişiminde optimum rhGH saptanmıştır. Bu koşullarda, Mut+ fenotip 0.052 kg m-3, Muts ise 0.16 kg m-3 rhGH üretmiştir. Tanımlı ortamda, sadece metanol karbon kaynağı olarak kullanıldığında, Muts fenotipi metanolu tam olarak kullanamadığından yeterli hücre derişimine ulaşamamış ve rhGH üretimi gerçekleşmemiştir. Mut+ fenotipi metanolu etkin olarak kullanabildiğinden, hücre çoğalmış ve %3(h/h)'lük metanol derişimde 0.032 kg m?3 rhGH üretebilmiştir. Gliserol ve methanol birlikte kullanıldığında, bu iki fenotip için en çok rhGH üretimi farklı metanol derişimlerinde bulunmuştur. Optimum gliserol derişimde, 30 kg m-3, Muts %1(h/h) metanol içeren ortamda 0.110 kg m-3, Mut+ %4 (h/h) metanol içeren ortamda 0.060 kg m-3 rhGH üretebilmiştir. Tasarlanan üretim ortamı kullanılarak (%3 (h/h) metanol içeren tanımlı ortam) biyoreaktör işletim parametrelerinden oksijen aktarımı; fermantasyon ve oksijen aktarım karakteristikleri pilot ölçek biyoreaktörde incelenmiştir. İnsan büyüme hormunu üretiminde oksijen aktarımının etkileri, hava giriş hızı Q0/VR=0.5 vvm; karıştırma hızları N=250, 500, 625, 750 dk-1 ve koşullarında incelenmiştir. İnsan büyüme hormonunun, hücre, amino asit, organik asit konsantrasyonlarının kalma süresi ile değişimi; dinamik yöntem kullanılarak, biyoprosesin büyüme evresi süresince , oksijen tüketim hızı ve sıvı faz kütle aktarım katsayısı; verim ve yaşam katsayıları belirlenmiştir. İncelenen koşullar arasında en yüksek hGH derişimi 0.023 kg m-3 olarak 5.37 kg m-3 hücre konsantrasyonunda Q0/VR=0.5 vvm ve N=500 dk-1 koşullarında elde edilmiştir. Anahtar kelimeler: İnsan büyüme hormonu, Pichia Pastoris, AOX1, ortam tasarımı, oksijen aktarım.