The Effects of cysteine 43 mutation on catalytic properties and thermostability of thermoplasma acidophilum citrate synthase
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 1996
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: İPEK ERDURAN
Danışman: SEMRA KOCABIYIK
Özet:oz SİSTEİN-43 MUTASYONUNUN THERMOPLASMA ACIDOPHILUM SİTRAT SENTETAZ ENZİMİNİN KATALİTİK ÖZELLİKLERİ VE YÜKSEK ISIYA DAYANIKLILI?I ÜZERİNDEKİ ETKİLERİ Erduran, İpek Yüksek Lisans, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Semra Kocabıyık Ocak 1996, 70 sayfa Sitrik asit döngüsünün girişindeki reaksiyonu katalizleyen sitrat sentetaz enzim mekanizması, enzim substrat ilişkisi, konformasyon değişiklikleri, protein kıvrılma ve bükülmelerini araştırmak için önde gelen sistemi oluşturur. Bu çalışmada proteinin yüksek ısıya dayanıklılığını moleküler bazda araştırmak amacıyla termofilik Archaeon, Thermoplasma acidophililum 'un sitrat sentetaz enzimini seçtik. İleriki çalışmalarda rekombinant enzimin belirli yerlerinin işaretlenip, bu yerlerin yapı ve bölgesel dinamik hareketlerini spektrofotometrik yöntemle inceleyebilmek için protien mühendisliği metodu ile enzimin bu noktalarının değiştirilmesi hedeflendi. Thermoplasma sitrat sentetazm üç boyutlu yapısı göz önüne alınarak seçilen iki değişik pozisyona (Ser-43 ve Ser-309) sistein grupları eklendi. Bu çalışmada, Cys-43 mutasyonunun enzimin biyokimyasal ve yüksek ısıya dayanıklılığı üzerindeki etkileri araştırılmıştır.Mutant ve mutant olmayan rekombinant enzimler Matrex Gel Red A affiniti kromatografisi sayesinde, substrat oksaloasetat ve ürün koenzimA karışımı ilave edilerek saf halde elde edilmiştir. Mutant olmayan enzimin 6.9 kat, mutantın ise 9.3 kat saf olduğu bulunmuştur. Kinetik özelliklerine bakıldığında, katalitik olarak iki enzimi birbirinden farklı olmadığı gözlenmiştir. Oksaloasetat için mutant olmayan enzimin Km değeri 1 0 |iM, mutant enziminki ise 1 0.2\ıM, asetil koenzim A için her biri söylediği sıraya göre 10.6 jıM ve 10.8 \ıM olarak bulunmuştur. Her iki enziminde 70°C 'da aktivitelerini sürdürüğü, 80°C 'da ise yan ömürün mutant olmayan için 23 dak., mutant enzim için 21 dak. olduğu bulunmuştur. Enzimlerin pH profilleri de benzer olup, optimum aktivite pH 8 'de gözlenmiştir. Mutant enzimdeki yeni Cys-43 grubu DTNB ile modifiye edilebilmiştir. Bu da eklenen -SH grubunun modifikasyonlara açık olduğunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Thermoplasma acidophilum, sitrat sentetaz, termofiller, Archaea, ısıya dayanıklılık. vı