Proteome analyses of Pb (II), Ni (II) and Cr (III) response in Phanerochaete chrysosporium
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2003
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: SERVET ÖZCAN
Danışman: GÜLAY ÖZCENGİZ
Özet:Bu çalışmada, Phanerochaete chrysosporiuwfxm Pb (II), Ni (II) ve Cr (İÜ) stresine karşı yanıt çeşitli yönleriyle, özellikle de proteom analizleriyle araştırılmıştır. Organizmada metal toleransının Pb (II)>Cr (Iü)> Ni (II) şeklinde sıralandığı ve bu metaller için MIC değerlerinin sırasıyla agar besiyerinde 1300 ppm, 200 ppm ve 35 ppm, sıvı besiyerindse ise 1200 ppm, 80 ppm ve 60 ppm olduğu bulunmuştur. Daha sonra, bu metallerin zamana bağlı biysorpsiyonlan çalışılmıştır. P. chrysosporium'vaı biyosorpsiyon kapasitesi en yüksek Pb (Il)'de bulunmuştur ve bu sıralamada Ni (II) ve Cr (111) arasındaki fark fazla önemli değildir. Hücrelerin Cr (Ill)'nin yüksek miktarlarım hızla içeriye aldıkları belirlenmiştir. Pb (D), esas olarak hücre yüzeyine bağlı kalmış ve biyosorpsiyonun ilk 30 dakikasında hücre içine alman Ni (II) iyonlarının sonraki 30 dakia içerisinde hücre dışına atıldığı ve sonra tekrar hücrelere girmediği gösterilmiştir. P. chrysosporium class II metallotiyonininin (MT) 7.73 kDa ağırlığında bir protein olduğu belirlemiştir. Bu proteinin metale maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak indüklenme kalıplarının üç ayrı metal için de aynı olması özellikle ilginçtir. Bu metallerin herbiri için 10 ppm gibi nispeten düşük bir doz kullanıldığında 15 dakikalık kısa metal uygulamaları herhangi bir yanıta neden olmamış, proteinin ortaya çıkması için en az 30 dakikalık bir uygulama gerekmiştir. 30 dakika ile 8 saat arasında değişen uygulamalarda proteinin ifade seviyesi uygulama süre arttıkça artmış ve 8 saatte en yüksek seviyeye ulaşmıştır. Süre 1 0 ve 24 saatlere uzatıldığında ise proteinin ifade seviyesinin düştüğü belirlenmiştir. Pb (II), Ni (II) ve Cr (III) yamtlanmn proteom analizleri yapılmış, kültür yaşı (to ve tıo'da metal uygulaması) herbir metalin değişik konsantrasyonları (5, 10, 15 ve 20 ppm), metale maruz bırakma süresi (15, 30, 60 dakika, 2, 4, 6, 8 saat) proteom analizinde incelenen değişkenleri oluşturmuştur. PDQUEST (Bio-Rad) programı kullanılarak nitel ve nicel 2DE analizleri yapılmış, metal baskısı sonucu indüklenen, kaybolan, 2 kat ve 4 kat artış ya da azalış gösteren proteinler programın vermiş olduğu özgün SSP (Standart spot sumarası) numaralan Mr ve pl değerleri ile tammlanmıştır. P. chrysosporium inokulasyon anında (to) Pb (II), Ni (II) ve Cr (III)' ün 5 ile 20 ppm arasında değişen konsantrasyonlarına maruz bırakılıp 40 saat süreyle üretildiğinde en az 56 [15 ppm Pb (II) ile], en çok 99 [10 ppm Cr (HI) ile] proteinde yukarıda söz edilen değişiklikler görülmüştür. Farklı kategorilerdeki değişiklikler incelenip ortalamaları alındığında, toplam protein sayısmda neden oldukları değişik bakımından bu üç metalin aslında farklılıklar göstermediği belirlenmiştir. Her bir metalin 10 ppm'lik seviyesine inkübasyonun 40. saatinde maruz bırakılan ve metal varlığında farklı sürelerle inkübe edilen hücrelerde ise en az 26 [Ni (II), 60 dakika] en çok 86 [Pb (H) 4 saat] protein değişikliğe uğramıştır. Pb (Il)'nin diğer metallere göre daha fazla proteinde değişikliğe sebep olduğu, bu metalin özelikle de metal stresine özgün, metale maruz bırakılmayan kontrol hücrelerinde mevcut olmayan yeni proteinlerin ortaya çıkmasında en etkili metal olduğu saptanmıştır. Proteom analizleri boyunca belirli proteinlerin üç farklı metal için ortak bir yanıt verdiği, diğerlerinin ise herbir muamele koşulu ve/veya metal çeşidi için özgün olduğu görülmüştür. Bu çalışmada rapor edilen proteinler, (i) belirli bir metal uygulamasına özgün bir yanıtı temsil eden, (ii) farklı metal muamelesi koşullarında teşhis edilebilen ve (iii) birden fazla metal tarafından indüklenen proteinlerdir. Bazı proteinler, metal uygulamalarmm başlangıcında (15 dakika içerisinde) hemen sentezlenirken, diğer bazıları oldukça geç hatta 10 saatlik bir metal uygulamasından sonra ortaya çıkmışlardır. Erken proteinlerin pek çoğunun uygulama sırasında bir süre sonra ortadan kaybolduğu ve bu proteinlerin yerini diğer başka proteinlerin aldığı kaydedilmiştir. Yine metalle indüklenen bu kısa ömürlü proteinlerin bir kısmı, metal muamelesi sürerken bir süre sonra yeniden ortaya çıkmışlardır. Diğer yandan metal stresi sonucu kaybolan proteinlerin bir kısmı metalle inkübasyonun sonuna dek (24 saat) tekrar görünmemişler, diğer bir kısmı ise bir süre kaybolduktan sonra tekrar sentezlenmişlerdir. Bu değişikliklerin tümü, metal stresine uğrayan hücrelerdeki yoğun protein yıkım-sentez döngüsüne işaret etmektedir. Literatürde ağır metal stresinin mikrobiyal proteomikleri üzerine çok sınırlı sayıda rapor mevcuttur. Şimdiki çalışmamızın, P. chrysosporium ve diğer beyaz çürükçül funguslarda metal yanıtına katılan proteinlerin MALDI-TOF MS veya mikrosekanslama yoluyla tanımlanacağı daha ileri çalışmalarda hedef proteinleri göstermesi bakımından yararlı olacağı beklenmektedir. Anahtar sözcükler: Ağır metal, Biosorpsiyon, Metallotiyonin, Proteom, Phanerochaete chrysosporium.