Cloning and expression of gerE and glmS genes in Escherichia coli and Bacillus subtilis, and investigation of their possible interrelation with bacilysin biosynthesis
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, BİYOLOJİ ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2022
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SERGEN AKAYSOY
Danışman: GÜLAY ÖZCENGİZ
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bacillus subtilis, basilisin isimli dipeptit antibiyotiği enzimatik olarak üreten Gram pozitif model bakteridir. Basilisin, N-terminalinde L-alanin ve C-terminalinde L-antikapsinden oluşan en basit biyoaktif peptitdir. Standard suş B. subtilis PY79un basilisin üretemeyen OGU1 isimli mutant türevi bacA-hedefli pMutinT3 insersiyonu yoluyla laboratuvarımızda daha önce oluşturulmuş, bacA::lacZ::erm::bacABCDEF genomic organizasyonuna sahip olduğu gösterilmişti. Yine laboratuvarımızda yürütülmüş olan RT-qPCR, transkriptom, sekretom, and proteom çalışmaları OGU1 ve PY79 arasında gen ekspresyonu bakımından çok sayıda gen için çok önemli farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. Şimdiki çalışmanın konusunu oluşturan gerE and glmS transkriptlerinin ve kodladıkları proteinlerin, PY79 suşuna göre OGU1da oldukça düşük seviyelerde ifade edildikleri gösterilmiştir. Bacillus subtilis'in, gerE ve glmS genleri OGU1de negatif regüle edilen genlere örnektir. Kendi regülonunun master proteini olan gerE, transkripsiyon regülatörlerinin LuxR-FixJ ailesine mensuptur ve sporulasyonun geç aşamalarında ana hücre kompartmanında ifade edilir. Glutamin-fruktoz-6-phosphate transaminaz enzimini kodlayan glmS ise hücre duvarı sentezinden sorumludur. Bu iki gen, ayrı ayrı E. coli DH5α, E. coli BL21 ve B. subtilis OGU1e klonlanmıştır. Sporların farklı kimyasallara karşı direnci, bu sporların jerminasyon profili, koloni morfolojisi ve pigmentasyonu dahil olmak üzere çeşitli fenotipik analizler ana suş PY79, mutant suş OGU1 ve gerE ve glmS genlerini yüksek seviyede ifade eden rekombinant OGU1 suşlarında yapılarak sonuçlar karşılaştırılmıştır. gerE ve glmS genlerinin saflaştırılmış proteinleri ile basilisin operonunun promotör bölgesi ve ayrıca saflaştırılmış basilisin molekülü ile gerE ve glmS genlerinin promotor bölgeleri arasındaki olası DNA-protein etkileşimlerini aydınlatmak için elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) yapılmıştır.