Molecular biology and geneties of dipeptide biosynthesis: The system is an essential component of quaum-sensing colobal regulation
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2000
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: AYTEN KARATAŞ (YAZGAN)
Danışman: GÜLAY ÖZCENGİZ
Özet:ÖZET DİPEPTİD BİYOSENTEZİNIN MOLEKULER BİYOLOJİ VE GENETİĞİ: SİSTEM, HÜCRE YOĞUNLUĞUNUN ALGILANDIĞI GLOBAL DÜZENLEME ZİNCİRİNİN ÇOK ÖNEMLİ BİR HALKASD3IR Karataş, Ayten Doktora, Biyoteknoloji Bölümü Tez yöneticisi: Prof. Gülay Özcengiz Ortak tez yöneticisi: Prof. Mohamed A. Marahiel Eylül 2000, 141 pages B. subtilis PY79'da (standard 168 susunun prototrofik türevi) dipeptid antibiyotik bacilysin biyosentezinden sorumlu genlerin izolasyonu için transpozon mutaj enezi yaklaşımı kullanılmıştır. Bloke olmuş mutantlar transpozon kütüphanesinden biyoassay yoluyla fenotipik olarak seçilmiş, daha sonra ESI-kütle spektrometri analizleri ile biyosentetik kapasiteyi tamamen kaybeden mutantlar belirlenmiştir. Transpozon kütüphanesinden 4 farklı bacilysin üretemeyen mutant [AKİ, AK2, AK3, and AK4] izole edilmiş, bu mutantlarda bloke olan genler klonlanmış, nükleotid dizileri analiz edilerek ilgili genler karakterize edilmiştir. Bu genler, sırasıyla, ihyA (timidilat sentetaz), ybgG (bilinmeyen protein, homoserin methyl VItransferazlara benzemektedir) ve oppA (oligopeptid permeaz) olarak belirlenmiştir. Opp proteinin bacilysin biyosentezi ile ilgisinin kanıtlanması, biyosentezin "hücre yoğunluğunun algılandığı" ve sporlanmamn (farklılaşmamn) başlamasından, kompetans oluşmasmdan ve bazı B. subtilis suşlannda surfaktin biyosentezinin gerçekleşmesinden sorumlu global kontrol (fosforelay sistemi) zincirinde esasiyel bir yer oluşturduğunu açığa çıkarması bakımından çok önemli bir bulgudur. İlgili fizyolojik çalışmalar, bu bulguyu daha da güçlendirmiştir. Yine bu çalışma kapsamında kısmen saflaştırılmış bir enzim fraksiyonu kullanılarak biyosentetik mekanizmaya ilişkin araştırmalar da yapılmıştır. In vitro bacilysin biyosentezi, sentezlenen antibiyotiğin saf bacilysin ile ince tabaka kromatografi ve biyootografi yöntemleri kullanılarak karşılaştırılması ile doğrulanmıştır. Yüksek basmçlı jel filtrasyon kromatografisi (Superdex 200 kolonu) ile büyüklüğü yaklaşık 125 kDA olarak belirlenen enzim, DEAE- Sepharose kolonu kullanılarak gerçekleştirilen yüksek basmçlı anyon kromatografisi ile daha ileri saflaştırılmıştır. Enzimatik bacilysin biyosentezinin ATP yada 2'-deoxy ATP'ye ve yapışım oluşturan amino asitlerin varlığına gereksinim gösterdiği gösterilmiştir. Amino asit aktivasyonu mekanizmasının belirlenmesi için, yapısındaki amino asitlerle, L- alanin ve L-anticapsin ile ATP- PPi ve ATP-Pi değişim reaksiyonları yapılmıştır. Enzim, L-alanin'e bağlı ATP- PPi değişim reaksiyonunu katalizlemiş, ancak diğer sübstratı L-anticapsin' i aym yolla aktive etmemiştir. Bir modifiye amino asit olan anticapsin'in "amino asit fosfat" formunda aktive edildiğine dair de herhangi bir ipucuna rastlanmamıştır. Pantotenik asitin biyosentetik enzimde yer aldığı gösterilmiş, L-alanin'in tiyoester Vllformunda enzime bağlandığının kamtianmsı pantotenik asit varlığına ilişkin sonucu desteklemiştir. Tüm bu bulgular, bacilysin biyosentezi mekanizmasının peptid sentetazlar için önerilen "çoklutaşıyıcı tiyokalıp modeli" ile tüm olarak örtüşmediğini göstermiş olup peptid biyosentezinde alternatif model(ler)in varlığma işaret etmiştir. Bu çalışmada, bacilysinin hızlı ve hassas tayini için HPLC-ESI kütle analizi yöntemi geliştirilmiş ve ilgili moleküler çalışmalarda etkin bir biçimde kullanılmıştır. Anahtar kelimeler: Bacilysin, bacilysin sentetaz, peptid antibiyotikler, sekonder metabolitler, B. subtilis, sporulasyon, kompetens. vuı