Construction of a choline oxidase biosensor
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2003
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: DENİZ YÜCEL
Danışman: VASIF NEJAT HASIRCI
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Kolinin vücutta gerçekleşen pek çok olayda vazgeçilmez önemi vardır. Kolin önemli nörotransmitterlerden asetilkolinin öncüsü olmasının yanısıra yağ asitleri, fosfat ve gliserolle birleşerek hücre çeperinin yapısında yer alır. Kolin eksikliği sinir sistemi rahatsızlıklarına, yağ asitlerinin karaciğerde birikmesine, kolesterol düzeyinin yükselmesine, yüksek tansiyona ve hafıza kaybına neden olabilmektedir. Bu nedenle biyolojik sıvılardaki kolinin hızlı bir şekilde tayin edilmesi önem taşımaktadır.Bu çalışmada, kolin tayini için bir kolin oksidaz biyosensörü hazırlanmıştır. Biyosensörün hazırlanmasında kolin oksidazdan önce glikoz oksidaz bir model enzim olarak kullanılmıştır. Oksijen elektrodunda kullanılmakta olan Teflon (politetrafloroetilen) membran ferröz amonyum sülfat (FAS, 0.1%, w/v) varlığında gama ışımasına maruz bırakılarak 2-hidroksietil metakrilat (HEMA, 15%, v/v) ile graft edilmiş ve bazı örneklerde çapraz bağlayıcı olarak etilen glycol dimetilakrilat (EGDMA, 0.15%, w/v) kullanılmıştır. HEMA graft edilen membranlar, enzimin kovalent bağlanmasını sağlamak için glutaraldehit veya epiklorohidrin ile aktive edilir. Enzim akti vitesi sübstrat eklenmesi ile gerçekleşen oksijen tüketimini temel alarak oksijen elektrodu ile ölçülür. Membranlarm karakterizasyonu çalışmalarında graft edilme koşullan ve mekanik özellikleri incelenmiştir. Sonraki çalışmalarda HEMA (15%) ve FAS (0.1%) çözeltisi içerisinde 24 saat gama ışımasına maruz bırakılarak hazırlanan membranlarm kullanılmasının uygun olduğu saptanmıştır. Mekanik test sonuçları HEMA ile graft edilmesinin Teflon membranlara esneklik kazandırdığı ve EGDMA kullanılmasınında graft edilen membranları daha sertleştirdiğini göstermiştir. Membranlarm optimizasyonu aşamasında membranlarm yüzeyine bağlanan enzim miktarının aktivite ölçümleri için yeterli olmadığı belirlenmiştir. Bu nedenle daha ince bir membran elde etmek için membran yapım aşamasında değişiklikler yapılmıştır. Yüzeye bağlanmış olan glikoz oksidaz ve kolin oksidaz enzimlerinin miktarı Bradford ve Lowry yöntemleri ile tayin edilmiştir. EGDMA ve epiklorohidrin aktivasyonu süresinin enzim aktivitesine etkisi incelenmiş ve membranlarm EGDMA kullanılmadan ve 30 dakika epiklorohidrine maruz bırakılarak hazırlanması gerektiği saptanmıştır. Yüzeye glutaraldehid ile bağlanan enzimlerin spesifik aktivitesinin epiklorohidrin ile bağlananlara göre daha yüksek olduğu saptanmıştır. Yapılan çalışmalarda elektrot üzerine doğrudan yerleştirilen membranlann spesifik aktivitesinin oksijen elektrodu içine serbestçe bırakılan membranlardan daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Yüzeye enzim bağlama aşamasında optimum kolin oksidaz konsantrasyonunun 2 mg/mL olduğu saptanmıştır. Tasarlanan kolin oksidaz biyosensörünün geniş bir doğrusal çalışma aralığı olduğu (0.052-0.348 mM) belirlenmiştir. Ölçüm sayısı arttıkça sensörün tepkisinde doğrusal bir düşüş olmuştur. Anahtar kelimeler: kolin, kolin oksidaz, Teflon membran, graft etmek