Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2002
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: Sedef Tunca
Danışman: GÜLAY ÖZCENGİZ
Özet:Aspartik asit ailesine bağlı amino asitlerin biyosentez yolunun lizine özgün dalındaki karbon akışı, Streptomyces clavuligerus tarafından üretilen vtgeniş spektrumlu bir B-laktam antibiyotiği olan sefamisin C'nin biyosentezinde hız sınırlayıcıdır. Bu çalışmada, Streptomyces clavuligerus NRRL 3585'in aspartik asit biyosentetik yolunun ilk iki reaksiyonunu katalizleyen enzimlerini kodlayan ask (aspartokinaz) ve asd (aspartat semialdehid dehidrojenaz) genleri ilk kez klonlanmış ve karakterize edilmiştir. Bu amaçla iki farklı E. coli vektörü üzerinde S. clavuligerus genomik DNA'sının dört mini kütüphanesi hazırlanmış ve rekombinant koloniler radyoaktif fosfat (P32) ile işaretlenmiş Nocardia lactamdurans' a ait ask-asd gen probları kullanılarak taranmıştır. Probla pozitif sinyal veren iki koloni bulunmuş ve bu pütatif klonlardan izole edilen rekombinant plazmidler E. coli CGSC 5074 (ask -), E. coli CGSC 5080 (asd ') and E. coli CGSC 5081 (asd ~) mutantlarına prototrof özelliklerini geri kazandırabilmişlerdir. Nükleotid dizi verisi ve kodon tercih analizi sonuçlan, üç eksiksiz open reading frame'in (ORFs) varlığına işaret etmiştir. ORF2, ORFl'in içinden başlayıp ORFl'le aynı stop kodonunu kullanarak sonuçlanmaktadır. ORF3 ve ORFl,2 birbirlerinden 2 nükleotid ile ayrıdırlar ve her biri sırayla 355 aa (M, 37 550), 421 aa (Mr 44 366) and 172 aa (Mr 18 129) olan proteinleri kodlamaktadırlar. Bu proteinlerin amino asit dizilerini veri tabanında mevcut diğer amino asit dizileriyle karşılaştırmak suretiyle, ORFl'in aspartokinazın büyük altünitesine, ORF2'nin aspartokinazın küçük altünitesine ve ORF3'ün de aspartat semialdehid dehidrogenaz enzimine karşılık geldikleri belirlenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, Streptomyces clavuligerus' un ask ve asd genlerinin, bu genleri genom üzerinde farklı bölgelerde içeren Streptomyces akiyoshiensis' dekinin tersine Mycobacterium, Bacillus Corynebacterium ve Amycolatopsis türlerinde olduğu gibi küme halinde organize olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, askafi geninin üst bölgesinde tespit edilen E. coli Ea70 promotorlarına benzeyen olası bir Streptomyces promotor bölgesinin yanısıra, asd geninin alt bölgesinde transkripsiyon terminatörü olarak görev yapabilecek, birbirini ters yönde tekrar eden bir nükleotid dizisi bulunmuştur. Klonlanan ask-asd gen kümesinin S. clavuligerus' da homolog gen ifadelerinin sağlanması ve bu genlerin çoklu kopyalarının sefamisin C üretimine etkilerinin belirlenmesi de bu çalışmanın amaçları arasında olduğundan, ask-asd gen kümesinin alt klonlanmasında kullanılmak üzere bir streptomyces plazmid vektörü (pNSTlOO) oluşturulmuştur. Bu vektöre ask-asd genleri takıldıkdan sonra rekombinant vektör kolaylıkla transforme edilebilen bir ara konakçı olan S. lividans'a. aktarılmıştır. Ancak klonlanmış DNA parçasının kaybedilmesi ve plasmid yapısının değişmesi sonucu stabil bir rekombinant elde edilebilmesi mümkün olmamıştır. Streptomycete konakçıda ortaya çıkan bu rekombinant plazmid instabilitesinin klonlanan genlerin iki ardışık promotor aracılığı ile aşırı miktarda ifade edilmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir.