An Optimization study on antidipteran (CRYIV type) toxin production
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 1997
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: MELEK ÖZKAN
Danışman: GÜLAY ÖZCENGİZ
Özet:öz ANTİDİPTERA (CRYIV TİPİ) TOKSİN ÜRETİMİNİN OPTİMİZASYONU Özkan, Melek Yüksek Lisans, Biyoteknoloji Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Gülay Özcengiz Yardımcı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. N. Gürdal Alaeddinoğlu Ocak 1997, 123 sayfa Bu çalışma, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis HD500'de Diptera grubu böceklere karşı aktif (CrylV tipi) delta- endotoksin sentazinin düzenlenmesisne ilişkin araştırmaları ve toksin üretimini arttırmak üzere kültür koşullarının optimizasyonunu hedeflemiştir. HD500 susunda sporulasyona özgül proteinlerin analizi, bu organizmanın ürettiği toksinlerin crylVB, crylVD ve cytA genlerinin ürünü olduğunu (sırasıyla 130 kDa, 72 kDa ve 28 kDa proteinlerdir) göstermiştir. Aynı proteinler, yine israelensis alttürüne bağlı diğer B. vithuhngiensis suşlannda da (4Q2-72, HD14 ve 33) gösterilmiştir. CrylVA ve crylVC genleri ile kodlanan 135 kDa ve 78 kDa'lık toksin proteinlere ise hiçbir susta rastlanmamıştır. Suşların plasmid profillerinin karşılaştırılmasıyla elde edilen sonuçlar, israelensis alttürüne bağlı suşların çoğunda 9 kb, 7.2 kb, 5.1 kb ve 3.9 kb'lık plasmidlerin korunduğuna işaret etmiştir. Değişik besiyerlerinde üretilmiş 24 saatlik kültürlerdeki toksin seviyeleri ve sporlanma frekansları temel alınarak, optimizasyon çalışmalarında Yousten's Synthetic Medium (YSM)'nin kullanılması öngörülmüştür. Bu çalışmalar, besiyeri kompozisyonunda bir seri değişikliğin yapılmasını içermiştir. Etkileri bakımından karşılaştırılan çeşitli organik ve inorganik nitrojen kaynakları içersinde, üreme faktörlerini temin eden maya özütünün de temini koşuluyla, (NH4)2HP04 her iki toksinin de en yüksek seviyede sentezini sağlamıştır. İnülin, dekstrin, mal toz, laktoz, sükroz, peyniraltı suyu ve gliserolün biyosentezi stimule edici, glukoz, nişasta ve melasın ise inhibe edici olduğu görülmüştür, inorganik fosfat, özellikle CrylVB sentezini önemli ölçüde etkilemekte olup sentez için bu mineralin 50-100 mM gibi yüksek konsantrasyonlarına gereksinim vardır. Antidipteran toksinlerin yüksek düzeyde üretimi için ayrıca 8x10" M Mg ve 5.5 x 10" M Ca ilavesi gereklidir. Diğer yandan, incelenen elementler içerisinde en kritik olanın Mn olduğu, 10"' M düzeyinde Mn ilavesi halinde her iki toksinin üretiminde çok önemli artışlar elde edildiği gösterilmiştir. İncelenen vııdiğer eser metallerin (Cu, Zn ve Fe) ise toksin sentezi üzerinde pozitif bir etkiye sahip olmadığı bulunmuştur. Ortamın pH'ını sabit tutmak üzere tampon kullanıldığında, farklı başlangıç pH'ları içerisinde (pH 5.5- pH 8.5 aralığında) CrylV üretiminin sadece pH 7.0'de gerçekleştiği görülmüştür. İnkubasyon sıcaklığının ise özellikle CrylVB sentezi üzerine çarpıcı bir etki yaptığı, bu proteinin biyosentezinin 25°C gibi düşük bir sıcaklığa gereksinim duyduğu belirtilmiştir. Toksin sentezinin izlendiği bu çalışmalar boyunca, üretici organizmanın üreme ve sporulasyonu da ölçülmüş ve sonuçlar Bacillus türlerinde sporlanma sekonder metabolit üretiminin ortak regulasyonu olasılığını da kapsayacak biçimde tartışılmıştır. Anahtar Kelimeler : Delta endotoksin (kristal protein); Biyosentez; Regulasyon; Biyoinsektisit; Bacillus thuringiensis subsp. israelensis vııı