Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2021
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: NOORALDEEN FATHI NOORALDEEN AYOUB
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Çağdaş Devrim Son
Eş Danışman: Müslüm İlgü
Özet:
Bakteriyel
mikroorganizmalar, dış ortamlarındaki potansiyel olarak zararlı asidik
koşulların üstesinden gelebilmek için çok sayıda ve çeşitli sistemler
geliştirmiştir. Özellikle, bazı patojenik ve diğer patojenik olmayan enterik
bakteriler, hücre içi asidifikasyona ve memeli midesinin aşırı asidik koşulları
altında hayatta kalmayı mümkün kılan hasara karşı koyabilmek için birlikte
çalışan bir dizi istisnai ve iyi organize edilmiş asit direnci (AR)
mekanizmasına sahiptir. Hem virülan hem de iyi huylu suşları ile ortak
Escherichia coli, nötr pH’a adaptasyonu göz önüne alındığında özellikle dikkat
çekicidir. Bu bakterilerde, düşük dış pH baskısı, bir sitoplazmik
pirodoksal-5′-fosfat (PLP) bağımlı amino asit dekarboksilaz ve bir iç plazma
membran amino asidi antiporter jenerik bileşenden oluşan oldukça güçlü proton
tüketimli AR sistemleri aracılığıyla etkili bir şekilde hafifletilir. Bir
substrat amino asidinin dekarboksilasyonu sonrasında bir ürüne ve CO2'ye
dönüştürülmesi protona bağımlı PLP katalizli bir şekilde elde edilir. Daha
sonra, dahili olarak üretilen dekarboksilasyon ürününün hem antiporter aracılı
değişimi hem de harici olarak yerleştirilmiş substrat amino asidi, sistemin
çalışmasını sağlar ve hücrenin pH homeostazının geri kazanılmasına yardımcı olur.
Bu sistemlerden biri, AdiA ve AdiC tarafından oluşturulan arginin bağımlı asit
direnci (ADAR) sistemidir: sırasıyla indüklenebilir arginin dekarboksilaz
enzimi ve arginin / agmatin antiportörü.
AR
sistemlerinin etkileyici yeterliliği ve özellikle bulaşıcı, hastalığa neden
olan enterik bakteriler tarafından kullanılanlar, büyük bir maliyete -
insanların refahına ve sağlığına - gelir. Bundan böyle, bu çalışmada, ADAR
sisteminin integral membran proteini (MP) AdiC'ye karşı beş 2’FY RNA aday
aptamerini (noorA, noorB, noorC, AdiC19 ve AdiC72) seçilimini gerçekleştirdik.
Kısaca, AdiC, BL21 (DE3) pLysS hücre hattında uygun prokaryotik ekspresyon
sistemi kullanılarak rekombinant olarak eksprese edildi ve his-etiketli AdiC,
daha sonra n-dodesil-β-D-maltopiranosid (DDM) kullanılarak çözündürme yoluyla
ekstrakte edildi ve metal afinite kromatografisiyle saflaştırıldı aynı
deterjanda. SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi)
ile onaylandıktan sonra, saf rekombinant AdiC, 2'F-Pirimidin ile modifiye
edilmiş aday RNA aptamerlerinin in vitro seçimi için Eksponansiyel
zenginleştirme (SELEX) ile 8 tur geleneksel Ligandların Sistematik Evrimine
tabi tutuldu. Son olarak elde edilen seçim kütüphanesinden oligonükleotid
sekansları klonlandı ve Sanger sekanslama ile belirlendi. Üç dizi (noorA noorB
ve noorC) 100 klon arasında bol miktarda bulundu ve bu nedenle sonraki bilişim
analizleri için temel olarak seçildi. RNAfold ve Kinefold programları
tarafından tahmin edilen birincil ve optimal (MFE) 2D ikincil yapıların
karşılaştırmalı analizleri ile hesaplamalı bir yaklaşım kullanarak, üç korunmuş
motifi belirleyebildik (bunlardan biri varsayılan yerel bağlanma alanı ve diğer
ikisi de stabilizatör olarak açıklandı) motifler) noorA, B ve C'de ve farklı
bir filogenetik ailede iki tane daha tanımlanmış dizide (AdiC19 ve AdiC72).
Ayrıca, bu beş proto-aptamerin uyduğu bir konsensüs ikincil yapı tanımladık.
Stabilizatör motiflerinin sonraki tahmin odaklı (in-siliko) mutasyonel
delesyonları, varsayılan bağlanma motifini barındıran alt yapının korunması
üzerindeki tahmini MFE yapılarının birçoğunda küresel etkilerini ortaya
çıkardı.
Bu
çalışmada elde edilen beş aptamer adayı, hastalardaki bakteriyel enfeksiyonları
değerlendirmek için (örneğin aptasensörler tarafından) veya antimikrobiyal
farmasötik ilaçlar veya ilaç verme ajanları olarak kullanılabilecekleri aptamer
bazlı teşhis ve tedavi alanlarında uygulama için çok yönlü ajanlar olarak
kullanılma potansiyeline sahiptir. bu enfeksiyonlar için. Temel bilimsel
araştırma düzeyinde, bu aptamerler, AdiC'nin yapısal özelliklerini ve
biyokimyasal işlevlerini daha iyi anlamak için de yararlı olabilir. Daha genel
olarak, son 20 yılda saflaştırılmış tam uzunluktaki proteinlere karşı SELEX
denemelerinin azlığı göz önüne alındığında, bu tez kendini, saflaştırılmış tam
uzunluktaki milletvekillerinin kullanılabilirliğine dikkat çeken ilke kanıtı
çalışmalarından biri olarak sunmaktadır. deterjan misellerinde MP
sulandırıldıktan sonra aptamerlerin seçimi. Bu savunuculuk, geleneksel protein-SELEX'in
hücre-SELEX'e göre sağladığı avantajlarla ve çözülebilir hücre içi ve hücre
dışı MP alanlarının hedef olarak kullanımıyla uyumludur. Bu tezin sonunda, çok
geçişli veya derin entegrasyon ve membranlar içindeki yakınlık nedeniyle
aptamer hedeflemesi için genellikle erişilemeyen Reseptörler, taşıyıcılar
ve kanallar gibi karmaşık MP'ler için mevcut özel bir fırsata odaklanıyoruz.