Aptamer bağlı yüzeylerde vegf ve interferon-γ proteinlerinin zenginleştirilmesi ve MALDI-MS ile tayinleri

Tez Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya A.B.D., Türkiye

Tez Danışmanı: Bekir Salih

Tezin Onay Tarihi: 2017

Tezin Dili: Türkçe

Özet:

Aptamerler çeşitli sayıda nükleotitlerden oluşan DNA, RNA oligonükleotitleridir. Nükleotitler arasında oluşan hidrojen bağları, van der Waals bağları gibi kovalent olmayan etkileşimler aptamerlerin üç boyutlu halini almasını sağlamaktadır. Bu özel üç boyutlu konformasyonu sayesinde hedef moleküle yüksek seçicilikte bağlanmaktadırlar. Hedef moleküle yüksek seçicilikte bağlanma özelliği bakımından antikorlara benzeyen aptamerler "kimyasal antikor" olarak adlandırılmaktadır. Son yıllarda çalışma koşulları ve özellikleri karşılaştırıldığında, aptamerler antikorlardan daha çok tercih edilmekterdir. En önemli üstünlüğü in vitro olarak laboratuvar ortamında sentezlenebilmesidir. Çalışma koşullarının uygunluğu ve hedef moleküle yüksek özgünlükte bağlanma istendiğinden dolayı saflaştırma, hastalık tanısı, biyoteknoloji ve biyosensör gibi birçok uygulama alanı bulunmaktadır. Bu uygulama alanlarında en yaygın kullanım şekli aptamerin belirli bir yüzeye bağlanması ile hedef molekülle etkileştirilmesidir. Aptamerler üstün özellikleri sayesinde yanlızca ilaçlar, peptitler gibi küçük yapılara değil proteinler, vitaminler ve bakteri sporları gibi büyük yapılara özgün olarak bağlanabilirler. Aptamerlerin bu çeşitli hedef molekülleri arasında proteinle etkileşimi oldukça dikkat çekicidir. Tez kapsamında çeşitli derişimlerde İnterferon- (IFN-) ve Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) proteinlerinin kendilerine özgü aptamer yapıları kullanılarak zenginleştirme çalışmaları yapılmıştır. Öncelikle proteinler ve aptamerler için uygun MALDI matriksinin bulunması için farklı matrikslerle MALDI-MS analizleri yapılmıştır. Aptamerin çapraz bağlayıcıya bağlanmasının kontrolünün ardından proteinin aptamerle etkileşiminin kontrol çalışmaları yapılmıştır. Proteinlerin çözelti formlarına ait ve zenginleştirme sonrasına ait analizleri yapılarak aptamer etkisi karşılaştırılmıştır. Elde edilen sonuçlardan IFN- proteini için 0.007 pmol/µL, VEGF proteini için 0.002 pmol/µL derişimlerinde zenginleştirme çalışmalarının başarılı olduğu görülmüştür. Polimerik yüzey miktarının etkisi, ortamda kullanılan tampon çözeltinin etkisi, yüzeyde peptit varlığı kontrolü gibi zenginleştirmenin daha iyi olmasını amaçlayan optimizasyon deneyleri de gerçekleştirilmiştir. Daha sonra farklı proteinlerin bulunduğu ortamda aptamer yapılarının özgünlükleri kontrol edilerek aptamerlerin karmaşık ortamda hedef proteinlerin zenginleştirmesinde başarılı olduğu görülmüştür. Aptamerin sadece protein ortamlarında değil büyük-küçük birçok molekülün olduğu ticari olarak satın alınan gerçek kan plazmasında hedef yapıya özgünlüğü incelenmiştir. Ayrıca yapılan çalışmalarda kanda miktarı düşük olan VEGF proteini için ek olarak ziptip işlemi (enzimatik parçalama sonrası ortamdaki DTT, IAA, tuz gibi kimyasalların uzaklaştırılmasını sağlayan işlem )uygulanmış ve bu işlemin peptit sinyal şiddetlerine etkisi incelenmiştir. MALDI-MS ile yapılan analizlerin sonuçlarına göre tez kapsamında kullanılan yöntem sayesinde IFN-γ ve VEGF proteinlerinin düşük derişimlerde zenginleştirilmesi başarılmış ve çözelti ortamında aynı derişimlerde gözlemlenemeyen peptit sinyalleri gözlemlenmiştir.