CRISPR/Cas13a genom düzenleme yöntemi ile domateste kahverengi meyve buruşukluk virüsü (ToBRFV)’ne karşı dayanıklı bitkilerin oluşturulması
AKSOY E., Yavuz C.(Yürütücü), Çalışkan M. E., Ulubaş Serçe Ç.
TÜBİTAK Projesi, 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı, 2024 - 2027
- Proje Türü: TÜBİTAK Projesi
- Destek Programı: 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı
- Başlama Tarihi: Ağustos 2024
- Bitiş Tarihi: Ağustos 2027
Proje Özeti
CRISPR/Cas sistemi günümüzdeki en etkin genom düzenleme teknolojilerinden biridir. Çinko parmak nükleaz (ZFN) ve transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleaz (TALEN) gibi konvansiyonel genom düzenleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında sağladığı birçok avantajdan dolayı bitki dahil birçok farklı organizmada temel genom düzenleme yöntemi olarak tercih edilmektedir. DNA dizilerinde düzenleme yapmak için Cas9 proteini, RNA dizilerinde ise Cas13 proteini kullanılmaktadır. Önceki çalışmalardan elde edilen bulgularda CRISPR RNAların (crRNA) Cas13 nükleaz olmadan dahi genomda düzenleme yapabildiği gösterilmiştir. Bitkileri enfekte eden virüslerin yaklaşık %90’ının RNA virüsleri olduğu bilinmektedir. Bu virüslerden birisi de son zamanlarda yayılış gösteren ve domates ile biberde ciddi ekonomik kayıplara neden olan domates kahverengi buruşukluk meyve virüsü (Tomato brown rugose fruit virus – ToBRFV)’dür. ToBRFV ilk olarak 2015 yılında Ürdün’de ortaya çıkmış ve oldukça sıkı önlemler alınmasına rağmen ülkemizde de son zamanlarda hızla yayılmaya başlamıştır. Bu viral etmene karşı kullanılan konvansiyonel mücadele yöntemleri dışında hem transgenik yaklaşımların kullanıldığı hem de genom düzenleme yöntemlerinin uygulandığı çalışmaların sayısı oldukça azdır. ToBRFV virüsünün genomunu hedef alan bir genom düzenleme çalışması ise henüz literatürde bulunmamaktadır ve bu durum mevcut projede yapılması planlanan çalışmaları özgün kılmaktadır. Bu proje kapsamında, farklı virüs izolatlarında kılıf ve hareket proteinine göre daha fazla korunmuş olan RNA-bağımlı RNA polimeraz (RdRp), hem Cas13a nükleazı (CRISPR/Cas13a) hem de Cas13a olmadan sadece crRNA (CRISPR/-) kullanılarak iki farklı yöntem ile susturulacaktır. Böylelikle ToBRFV’ye karşı dayanıklılık gösteren domates bitkilerinin oluşturulması hedeflenmektedir. Bu yöntemin tasarlanması aşamasında insanlardaki anti-viral aşı geliştirme çalışmaları örnek alınmıştır ve bunun için bitki kaynaklı olan RdRp değil viral kaynaklı RdRp hedeflenerek direkt virüsün genomunda sistemik bir düzenleme yapılması amaçlanmıştır. Bu nedenle 34 farklı ToBRFV izolatının RdRp sekanslarında çoklu karşılaştırma yapılarak RdRp bölgesinden dört adet crRNA tasarlanmıştır. Bu crRNA’lar, öncelikle pK2GW7 vektörüne klonlanacak, sonrasında ToBRFV’ye hassas olduğu bilinen bir domates çeşidine (Moneymaker) Agrobacterium tumefaciens bakterisi aracılığıyla aktarılacaktır. Tek kopya vektör bulunduran ve yüksek seviyede crRNA ve/veya pCas13a ifadesi gösteren en az on adet T0 hattı oluşturulacaktır. T0 bitkilerinden alınacak tohumların çimlendirilmesiyle T1 bitkileri elde edilecektir ve bu bitkilerin ToBRFV ile inokülasyonu yapılıp tepkileri incelenecektir. On gün boyunca bitkilerden morfolojik gözlemler alınacaktır ve yapraklardaki viral yük belirlenecektir. Analizler ve gözlemler sonucunda her deneme için dayanıklılığı en yüksek ikişer bitki alınacak, ToBRFV RdRp lokusundaki mutasyonları saptamak için virüs RNA’sı izole edilecek ve dizilemeye gönderilecektir. Mutant bitkilerde ToBRFV RdRp hedeflendiğinden dolayı virüsün replike olamayacağı düşünülmektedir ve böylelikle bu çalışma ile hem Cas13a nükleazı varlığında hem de Cas13a olmadan ToBRFV’ye karşı dayanıklılık sağlanabilek midir hipotezi araştırılacaktır. Projenin sonunda yapılacak olan ek çalışma ile ToBRFV’ye dayanıklı mutant bitkilerin morfolojik ve bazı agronomik özellikleri de gözlemlenecektir. pCas13a proteini içermeyen fakat crRNAlar sayesinde ToBRFV’ye karşı dayanıklılık geliştirilmesi durumunda bu yöntemin ticari olarak kullanımı da mümkün olacaktır. ToBRFV virüsü henüz kısıtlı bir alanda yayılım göstermektedir fakat şimdiden ülkemizdeki tarımsal üretime oldukça zarar vermektedir. Bu şekilde klasik mücadelenin yanı sıra bu viral etmene karşı alternatif bir yöntem kullanılmasının önü açılmış olacaktır.