Metabolik mühendislik ve reaksiyon mühendisliği prensipleriyle insan büyüme hormonu üretimi için yeni biyoteknolojik proses geliştirilmesi


Çalık P. (Executive)

TUBITAK Project, 2015 - 2018

  • Project Type: TUBITAK Project
  • Begin Date: May 2015
  • End Date: May 2018

Project Abstract

İnsan büyüme hormonu  (hGH), 22 kDa molekül ağırlığında, 191 amino asitten oluşan, beynin ön lobundaki hipofiz bezi tarafından üretilen bir proteindir. Hipofiz bezlerindeki somatotropik hücreler tarafından doğal olarak sentezlenen, kanda bulunan hGH’nin, insan organizmasında eksik, bozuk (defective) üretiminin neden olduğu problemlerin düzeltilmesi için dışarıdan verilme ihtiyacı –diğer hormonlar gibi- bu farmasötik temel maddenin biyoteknolojik prosesle endüstriyel üretimini önemli yapmaktadır. Bu proje kapsamında, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz başlatıcısının (promotör) (PGAP) üzerinde bulunan transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgelerini transkripsiyon mühendisliği ile modifiye ederek rekombinant protein (r-protein) üretimini artırmak hedeflenmiştir. Pichia pastoris’te en çok kullanılan başlatıcılardan biri olan PGAP, olası transkripsiyon faktörlerinin (TF) bağlanma bölgeleri açısından analiz edilmiştir. Bulunan TF bağlanma bölgeleri silinerek ya da doğal konumlarında duplike edilerek PGAP varyant kütüphanesi oluşturulmuştur. Aynı zamanda, seçilen TF’ler aşırı-ekspres edilerek ya da silinerek, bu faktörlerin r-protein üretimine etkisi araştırılmıştır. Geliştirilen PGAP varyantları altında modifiye yeşil floresan proteini üretiminin ekspresyon seviyeleri, doğal PGAP’a kıyasla 0.35-3.10 kat arasında değişim göstermiştir. En yüksek ekspresyon seviyelerine ulaşan başlatıcı varyantları olan Pro9 (Gal4-benzeri TF bağlanma bölgesinin duplike edildiği) ve Pro10 (Rfx1 bağlanma bölgesinin silindiği) kontrolü altında ikinci model protein, rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH), ekspres edilmiş; doğal PGAP’a kıyasla, sırasıyla, 2.4 ila 1.6 kat daha fazla rhGH üretilmiştir. Yarı-kesikli biyoreaktör işletim koşullarında, Pro9 kontrolü altında ve Gal4-benzeri TF’nin aşırı-ekspres edildiği suş ile rhGH üretiminde birim hücre başına 2.2 kat artış elde edilmiştir. Geliştirilen hibrit yarı-kesikli işletim ile en yüksek rhGH derişimi t = 8 st’te, CrhGH = 611 mg dm-3 elde edilmiştir.