Maya Yüzey Gösterim ve Faj Gösterim Yaklaşımları ile Amiloid Oluşumunu Engelleyici Peptit Ligandlarının Seçilerek Protein Aggregatı Oluşumunun Kinetik ve Termodinamik Olarak Kontrol Edilmesi

TÜBİTAK - AB COST Projesi , 2018 - 2020

Proje Türü: TÜBİTAK - AB COST Projesi
Başlama Tarihi: Şubat 2018
Bitiş Tarihi: Ekim 2020

Proje Özeti

Sunulmakta olan projenin amacı Huntington hastalığı, Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığında protein agregatlarının oluşumuna neden olan çözünür haldeki oligopeptit ve protein monomer ve oligomerlerinin meydan getirdiği toksik etkiyi moleküler tanıma yoluyla engelleyici kısa peptid moleküllerinin geliştirilmesidir. Bu bağlamda sunulan proje bu proteinlerin hem patolojik olarak oluşturdukları agregatların engellenmesi, hem de varlıklarının saptanmasına yönelik bir yöntem üzerinde odaklanmaktadır.

Amiloid fibrilleri polipeptit moleküllerinin supramoleküler etkileşimlerle bir araya gelerek oluşturdukları hiyerarşik yapılardır. Bir hastalığa bağlı olarak rastlanılan amiloid proteinlerden en bilinenleri Tip 2 diyabet, arterosikleroz, ya da beyinde meydana gelen nörodejenenerasyona neden olan Alzheimer hastalığı, Huntington hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi rahatsızlıklarda ortaya çıkan amiloid agregatlarıdır. Çalışma kapmasında ele alınacak olan nöredejeneratif hastalıklarda, amiloid protein birikmesi nöron hücrelerinde toksik etkilerin ortaya çıkmasına neden olmaktadırlar. Oluşacak amiloid birikiminin önüne geçebilmek için farklı ilaç moleküllerinin geliştirilmesine yönelik çalışmalar hızla devam etmektedir. Genellikle, amiloid oluşturan monomerik ve oligomerik yapıların ve de bunların supramoleküler etkileşimlerle biraraya gelerek oluşturdukları amiloid yapılarının farklı aşamalarda toksik etkiler gösterdikleri ve hücre ölümüne neden olduklarına dair bulgular ortaya konmuştur. Amiloid oluşumu sırasında, oluşan monomerik proteinlerin konformasyonel değişikliklere uğramamış olan proteinlerle etkileşmeleri sonucunda (docking) onların da yapısal değişikliklere uğramasına neden olmaktır. Oluşan bu oligomerik birimler aynı mekanizma ile farklı monomerik proteinlerinden yapısal değişikliklere uğramak yoluyla hızla artan sayıda monomerik ünitelerden oluşan fiber yapılarının çözünmez biçimde oluşmasına sebebiyet vermektedir (locking). Oluşan bu yapıların en önemli özelliklerinden birisi de, her oluşan oligomerik yapının aslından hızla bir çekirdeklenme (nucleation) birimi gibi davranarak yeni amiloid fibrillerinin ve agregatlarının oluşumuna olanak sağlamasıdır. Bu bağlamda bahsi geçen amiloid oluşumunun engellenmesi amacıyla farklı yaklaşımların geliştirilmesi zorunlu hale gelmiştir.

Alzheimer hastalığında hücre dışında oluşan (Aß40 ve Aß42 peptidlerinin APP proteininden kesilmesi sonrasında) amiloid yapıları toksik etkiye neden olurken Parkinson hastalığında ise hücre içerisinde anormal katlanan ?-synuclein proteinin agregasyonu sonrasında nörodejenerasyon ve nöroenflamasyon ortaya çıkmaktadır. Huntington hastalığından meydana gelen nörodejenerasyon ise, huntingtin proteinini kodlayan htt genlerinde meydana gelen mutasyona bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Bu mutasyon sonucunda oluşan mutant huntingtin proteinleri agregatlar oluşturmaktadırlar ve nöronlar içerisinde biriken bu agregatların toksik etkiye neden oldukları gösterilmiştir. Amiloid protein oluşumunu engellemenin ya da kontrol altına alabilmenin ilk yolunu oluşan amiloid öncülü proteinlerinin bloke edilmesi ile mümkün olabileceği öngörülmektedir. Bu konuda farklı biyoaktif moleküllerin ortaya konması söz konusu olsa da bu moleküllerin büyük kısmının monomerik ya da oligomerik yapılara karşı değil amiloid proteinlere bağlanma kabiliyetlerine göre seçilmektedirler. Monomerik proteinerin bloke edilmesi elzem olduğundan çalışmamızın bu yönde odaklanacaktır. Sunmakta olduğumuz çalışma kapsamında Saccharomyces cerevisiae hücrelerinin hücre yüzeyinde gösterilecek olan monomerik proteinlere karşı, faj gösterim yoluyla oluşturulmuş peptit kütüphanelerinden monomerik ve oligomerik proteinleri bloke edici peptidlerin seçilmesi hedeflenmektedir. Seçilecek peptit ligandlarının moleküler bağlanma etkinliklerinin karakterize edilmesi ve ex-vivo ve in vitro hücre kültürü düzeyinde etkinliklerinin incelenmesi hedeflenmektedir. Seçilecek peptitlerle oluşumu kontrol altına alınacak olan agregatların mekanik karakterizasyonları da tamamlanarak yapı-işlev ilişkisi bakımından incelenecektir. Bunların yanısıra, elde edilecek olan ligandların tanıyıcı moleküller olarak kullanıldığı biyosensör oluşturulması da öngörülmektedir. Bu çalışma kapsamında literatüde ilk defa monomerik amiloid öncülü moleküllere karşı iki aşamalı olarak peptit ligandların seçilmesi hedeflenmektedir. Ayrıca ortaya konacak peptidlerin, hem hücre dışı bağlanma etkinlikleri ile karakterize edilip ve bağlanma özelliklerinin iyileştirilmesine yönelik çalışmaların ortaya konacak olması hem de sonrasında hücre kültüründe test edilerek karşılaştırılmalı bir çalışma ortaya konacak olması da diğer özgün bir noktadır.

Çalışma kapsamında öncelikle Aß40 ve Aß42 peptidleri ve bunların tandem tekrarları, huntingtin proteininin farklı poliglutamik asit tekrarlı versiyonları (mutant olmayan 20 polyQ, mutant olan 45 ve 56 ), ?-synuclein (insan) proteinleri hazırlanacak olan Aga1 ve Aga2 S. cerevisiae yüzey proteinlerine füzyon edilmiş halde, maya yüzeyinde hazırlanacaktır. Hazırlanacak olan bu farklı protein versiyonlarını taşıyan maya hücrelerine karşı M13 bakteriofajının 7 ve 12 aminoasit uzunluğunda peptit içeren kütüphanesi kullanılarak bir tarama yapılacaktır. Son aşamada elde edilecek olan peptitlerin etkinlikleri bu peptidlerin katı faz ile sentezlenmeleri ve bir raportör protein ile füzyon halde takiben kütle hassas yöntemlerle tayin edilecektir. Gerekli görülmesi halinde elde edilecek olan peptidlerde tandem tekrarlar oluşturulması ya da nokta mutasyonlarla beraber, iyileştirmeler yapılması öngörülmektedir. Son aşamada ise elde edilen ve floresans proteinlerle füzyon haline peptidlerin nöron hücrelerinde plazmit üzerinden üretilecek olan amiloid proteinlerle olan etkileşimleri incelenerek, amiloid oluşumuna etkileri irdelenecektir. Bu bağlamda elde edilen peptid ligandlarının tanıyıcı özelliklerinin aynı zamanda oluşturulacak biyosensör sitemlerinde de amiloid oluşumuna yönelik olarak ilk sinyallerin toplanmasında kullanılabilecek potansiyelde olmasında yola çıkılarak yüzey hassas sensör sistemlerinin geliştirilmesinde ortaya konacaktır.

Bu çalışma sonucunda elde edilecek olan bilgi ve bulgular sonrasında, ilaç adayı peptidik moleküllerin geliştirilmesine, hızlı olarak amiloid öncülü proteinlerin hızlı tanınmasına ve agregat oluşumunun farklı aşamalarının mekanik özelliklerinin oluşmasına yönelik kapsamlı çalışmalara doğru bir adam atılmış olacaktır. Bu bağlamda temel düzeyde ancak sonrasında klinik düzeyde etkinliğe sahip bir potansiyele sahip olacaktır.