RNA metabolizması regülatörleri CPL1 ve RCF3’ün miRNA işlenmesindeki rollerinin demir eksikliği altında Arabidopsis thaliana’da belirlenmesi

AKSOY E. (Yürütücü)

TÜBİTAK Projesi, 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı, 2024 - 2026

Proje Türü: TÜBİTAK Projesi
Destek Programı: 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı
Başlama Tarihi: Nisan 2024
Bitiş Tarihi: Ekim 2026

Proje Özeti

Bitkilerin büyümesi ve gelişimi ile verim için önemli bir mikro-besin maddesi olan demirin (Fe) eksikliği özellikle kireçli topraklarda yetişen bitkilerde daha şiddetli görülmektedir. Demirin rizosferden kök içerisine alınması için Arabidopsis thaliana gibi dikotlar indirgenme stratejisi geliştirmişlerdir. Kök epidermisine alınan Fe kök perisiklını geçerek ksilem aracılığıyla yeşil aksama taşınır. Tohum gelişimi ve yaprak dökülmesi dönemlerinde ise floem aracılığıyla dağıtımı sağlanır. Bütün bu Fe homeostaz yolakları genellikle bHLH ailesindeki transkripsiyon faktörleri tarafından kontrol edilir. Ancak, Fe homeostazı çok katmanlıdır. Bugüne kadar bitkilerde post-transkripsiyonel modifikasyonlardan sorumlu microRNA’ların (miRNA’ların) ifade seviyeleri ile bunların hedef genleri farklı bitkilerde çalışılmıştır. Ancak, Fe eksikliği altında miRNA işlenmesi üzerine yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. MIR genlerinin RNA polimeraz II tarafından ifade edilmesiyle önce öncü miRNA’lar (pri- ve pre-), bunların işlenmesiyle de olgun miRNA’lar üretilir. Olgun miRNA işlenmesinden sorumlu işleme (mikroprosesör) kompleksinin ana bileşenleri; RNase III enzimi olan DCL1 (Dicer-like 1), çift sarmallı RNA’lara (dsRNA’lara) bağlanabilen bir protein olan HYL1 (HYPONASTIC LEAVES1) ve bir C2H2 tipi çinko parmak proteini olan SE (SERRATE)’dir. Bu proteinlerin işlev görebilmesi için ise kompleks içerisinde dsRNA bağlama bölgesine sahip bir defosfataz olan CTD-PHOSPHATASE-LIKE1 (CPL1) ve bunun eşlenikçisi REGULATOR OF CBF GENE EXPRESSION3 (RCF3)’e ihtiyaç duyulmaktadır. Araştırma grubumuz dahil iki farklı grup tarafından yapılan çalışmalarda, CPL1’in HYL1 ve SE’ye bağlanarak, HYL1’nin defosforilasyonunu sağlayıp, düzgün miRNA işlenmesini kontrol ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, CPL1 ve RCF3’ün abiyotik ve biyotik stres toleransında önemli rollerinin olduğu gösterilmiştir. Yine tarafımızdan yapılan bir çalışmada, CPL1’in mutasyonu sonucu, Fe eksikliği ve Cd toksisitesine karşı A. thaliana bitkisinin göstermiş olduğu tolerans mekanizmalarının aktifleştiği belirlenmiştir. CPL1’in miRNA işlenmesindeki rolleri de dikkate alınınca CPL1’in Fe eksikliği altında stresle ilişkili miRNA’ların ifade seviyeleri, düzgün işlenmeleri ve hedef genlerin post-transkripsiyonel regülasyonundaki olası etkilerinin incelenmesi gerekmektedir. Önerilen projenin amacı; RNA metabolizma regülatörü CPL1 ve etkileşime girdiği RCF3’ün demir eksikliği altında üretilen miRNA’ların işlenmesindeki etkileriyle üretilen bu miRNA’ların hedef genlerinin ifade seviyelerinde nasıl bir değişikliğe neden olduğunun incelenmesidir. Demir eksikliği altında cpl1, rcf3 ve cpl1rcf3 mutantlarının kök ve gövdelerindeki miRNA ifade seviyeleri, miRNA’ların doğru işlenip işlenmemesi ve bunlarda CPL1 ile RCF3’ün görevlerinin araştırılması; demir eksikliğinin anlaşılabilmesi için yüksek önem taşımaktadır. Bu nedenle, proje önerisi özgündür. Bu amaç doğrultusunda, 30 ay ve 5 iş paketi olarak kurgulanan projede öncelikle cpl1-6, rcf3-1 ve cpl1-6rcf3-1 mutantlarının demir eksikliğine karşı göstermiş oldukları fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler tepkileri belirlenecektir. Ardından, Fe eksikliği altında yetiştirilen cpl1-6, rcf3-1 ve cpl1-6rcf3-1 mutantlarının kök ve gövdelerinde ifade edilen veya ifadesi değişen miRNA’lar ile işlenmesinde problem olan miRNA’lar yeni nesil dizileme ile miRNAome profili sayesinde belirlenecektir. Devamında, Fe eksikliğine maruz kalan cpl1-6, rcf3-1 ve cpl1-6rcf3-1 mutantlarında, işlenmesinde problem olan en az 5 ortak miRNA’nın işlenmesindeki problemler miRNA/miRNA* oran hesaplaması ve in vitro pri-miRNA işleme analizi yöntemleriyle doğrulanacaktır. Bunun için, 35S:DCL1-cMyc/cpl1-6, 35S:DCL1-cMyc/rcf3-1, 35S:DCL1-cMyc/cpl1-6rcf3-1 ve 35S:DCL1-cMyc/Col-0 transgenik (T3) bitkileri geliştirilip Fe eksikliğine uğratılacak ve ardından bitkilerinden elde edilecek DCL1 ile ilişkili mikroprosesör kompleksinin kullanılacağı in vitro pri-miRNA işleme analizi yapılacaktır. Ayrıca, bu miRNA’ların işlenmesindeki problemin doğrudan CPL1 ve RCF3 ile ilişkili olduğunu ispatlamak için in vitro pri-miRNA işleme analizinin içerisine artan miktarlarda rekombinant CPL1 ve RCF3 proteinleri eklenecektir. Son aşamada, Fe eksikliğine maruz kalan cpl1-6, rcf3-1 ve cpl1-6rcf3-1 mutantlarında, ifade seviyesinde en çok değişiklik gösteren ortak 5 miRNA’nın hedefi olan mRNA’ların ifade seviyeleri belirlenecektir. Proje kapsamında iki yüksek lisans öğrencisi yetiştirilerek tez hazırlanacak, en az 2 SCI yayın ve 2 bildiri yapılacaktır. Projeden elde edilecek çıktıların ders kitaplarına girme potansiyeli bulunmakla birlikte, buradan elde edilecek bilgiler ışığında Fe eksikliği toleransında miRNA temelli post-transkripsiyonel düzenleme sayesinde ileride kültür bitkilerinin demir eksikliğine toleransıyla ilgili moleküler markırlar veya transgenik hatlar geliştirilebilir. Dolayısıyla, uzun vadede projeden elde edilecek çıktıların ürüne dönüşme potansiyeli mevcuttur.