Protein Mühendisliği Ve Sentetik Biyoloji Yaklaşımları Ile Biyofilm Protein Polimerlerinin Biyoaktif Yüzeyler Oluşturmak Üzere Biyoyapışkan Malzemeler Olarak Düzenlenmesi

TÜBİTAK - AB COST Projesi , 2017 - 2020

Proje Türü: TÜBİTAK - AB COST Projesi
Başlama Tarihi: Mart 2017
Bitiş Tarihi: Mart 2020

Proje Özeti

Bu projenin amacı bakteri biyofilm proteinlerinin, yüzeyleri işlevselleştirmek amacıyla biyoyapıştırıcı olarak kullanılmasına yönelik çalışmalar ortaya koymaktır. Bu amaca yönelik olarak Pseudomonas flourescence, Bacillus subtilis ve Vibrio cholorea bakterilerine ait olan biyofilm genlerinin klonlanması, bu genlerin ürünü olan proteinlerin üretilmesi hedeflenmektedir. Ancak burada sadece bu proteinlerin üretimleri değil aynı zamanda Camplyobacter jejuni?de karakterize edilen bir glikolizasyon yolağının da kullanılması ile bu proteinlerin glikolize edilmesi hedeflenmektedir. Doğal biyofilm yapılarında yer alan farklı polisakkaritlerin biyofilmlerin farklı yüzeylere yapışmasında oynadığı rol gözönüne alınarak biyofilm proteinlerinin glikolizlenmesinin biyofilm proteinlerinin ek olarka karbohidratlar ihtiyaç duymadan yüzeylere yapışma özelliğinin artmasını sağlayacağı öngörülmektedir. Bu amaçla literatürde ilgili organizmaların biyofilm yapıları içerisinde belirlenmiş olan FapB, FapC (B. Subtilis), TasA-TapA (Pseuomonas floresens) ve RbmA-RmbC-Bap1 (V. cholorea) proteinlerinin Esherichia coli içerisinde üretilmesi hedeflenmektedir. Aynı hücreye aktarılacak C. jejuni glikolizleme yolağının da periplazmik alanda üretilen biyofilm proteinlerini glikolize etmesi planlanmaktadır. Bu sayede biyofilm proteinlerinin biyoloji kökenli yapıştırıcılar olarak kullanılabilmesi öngörülmektedir. Bu protein yapılarının saflaştırılmalarının yanısıra, E. coli hücresinin mikrobiyal bir hücre fabrika olarak kullanılarak doğrudan hücre dışına salgılanmasının sağlanarak yüzeylerin adezyon özelliklerinin değiştirilebilmesi ve işlevsellik kazandıırlması hedeflenmektedir. Bu sayede biyomedikal uygulamalar, biyoteknoloji uygulamlarında kullanılmak üzere, kendi kendini yenileyebilen; yüzeylere tutunma özelliği yüksek kolayca fonksiyonel grupların eklenebileceği bir sistemin oluşturlması hedeflenmektedir.

Bilindiği üzere böcek ağları, midye yapışkan proteinleri gibi pekçok ökaryatik organizmaya ait protein yapılarının biyoyapıştrıcı olarak ve yüzey işlevselleştirilmesi için kullanılmaları üzerine çalışmalar mevcuttur. Bu çalışmalar kapsamında elde edilen sonuçlar ortaya koymuştur ki biyolojik organizmalar kaynaklı malzemeler yapıştırıcı olarak kullanıma oldukça uygundurlar ve kolay üretilebilmeleri, kimyasal sentez içermemeleri gibi pekçok üstün özelliğe de sahiptirler. Ancak bugüne kadar bu tarz malzemeler biyolojik ağların karmaşasını gözardı edilerek sadece tek bir tür moleküle indirgenmiş minimalist bir yaklaşımla ele alınmıştır. Bu boşluğu doldurmak amacıyla grubumuzun üzerinde çalışmalar yürüttüğü ve deneyim sahibi olduğu biyofilm proteinlerinin biyomedikal ve biyoteknoloji uygulamalarında kullanmak amacıyla, yüzey işlevselleştirilmesine hazır hale getirmek amacıyla bu projeyi sunmaktayız. Biyofilm proteinleri bugüne kadar enfeksiyon hastalıkları ya da endüstriyel problemlere neden olmaları ile bilinmektedir. Biyofilm yapıları, proteaz gibi enzimlerin etkisine karşı sahip oldukları amiloid yapısı nedeniyle oldukça dirençlidirler. Biyofilm yapısını oluşturan proteinler ve genel mimarileri sıcaklık, asidite gibi çevresel olumsuzluklara son derece dayanıklıdırlar. Bunun yanısıra biyofilmlerinin bakteri hücrelerinin kendilerini yüzeylere sabitlemek amacıyla kullandıkları düşünüldüğünde aslında yüzey işlevselleştirilmesi amacıyla- yukarıda sıralanan özellikleri de göz önüne alındığında- kullanımının yerinde bir yaklaşım olacağı görülebilir. Önerdiğimiz proje kapsamında yer alan biyofilm proteinleri, biyofilm yapısı içinde tek başlarına bulunmamaktadırlar, bu nedenle orijinal yapı içerisinde yer alan polisakkaritlerin yukarıda da belirtildiği gibi biyofilm protein yapısına eklenmesi amacıyla glikolizlenmeleri sağlanacaktır. Bu akış içerisinde öncelikle orijinal proteinler tek tek üretilecek, saflaştırılacaktır. Ancak bahsedildiği gibi burada aynı proteinlerin farklı versiyonları, yani glikolizlenmiş olanlar ve olmayanlar şeklinde üretileceklerdir. Her biri saflaştırılan proteinlerin glikolizlenme seviyeleri test edilecektir. Sonrasında, orijinal protein ile glikolize proteinlerin ikincil yapı değişimleri incelenecektir. Bu verilerin ışığında, her bir durum için monomerik proteinlerin biyofilm benzeri polimerleri oluşturmasına dair deneyler yapılarak, oluşan yapılar karakterize edilecektir. Bu yapıların çelik, altın, silika ve hidroksiapatit yüzeylerine yapışma özellikleri kuvartz kristal mikroterazi, atomik kuvvet mikroskobu ile nicel olarak berlilenecektir. Glikolizasyonun biyofilm proteinlerinin yüzeye tutunma özelliklerine olan etkileri ortaya konacaktır. Bu veriler taramalı ve geçirmeli elektron mikroskobu ile yapılmış olan analizlerden elde edilecek olan sonuçlar ile birleştirilerek, farklı yüzeyler için hangi protein polimlerlerinin en iyi oldukları saptanacaktır. En iyi polimerik yapılar konsatrasyona bağlı olarak, çarprazlanarak hibrit protein yapılarının oluşturulması sağlanacaktır. Bu sayede her bir yüzey için en iyilenmiş protein polimerleri (glikolize-glikolize olmamış ya da glikolize-glikolize gibi) oluşturulacaktır. Oluşturulacak bu yapıların her birinin yüzeylerde yapışma özellikleri bakımından tekrar karakterize edileceklerdir. Bu karakterizasyonların tamamlanmasından sonra, teker teker proteinlerin saflaştırılmasına gerek duymayacak bir sistem oluşturmak amacıyla sentetik bir gen devresi üzerinden genetik regülasyon sistemi oluşturulacaktır. Bu sayede protein polimer sisteminde yer alan proteinlerin bir genetik mantık devresinin oluşturulduğu E. coli hücresi tarafından çevresel sinyallere bağlı olarak yapışkan biyofilm proteinlerini üretmesi (optimize sisteme göre glikolize edilmiş ya da edilmemiş) hedeflenmektedir.

Proje kapsamında önermekte olduğumuz çalışmalarla elde etmeye çalıştığımız yapışkan biyofilm proteinleri literatürde daha önce glikolizasyon üzerinde ya da başka kimyasal işlemler üzerinden gösterilmemiş bir yöntemdir. Bu anlamda son derece yenilikçi bir yaklaşım olarak biyomedikal mühendislik uygulamalarında yeni biyoaktif yüzeylerin oluşturulmasında rol oynayabilecek yeni bir teknoloji oluşturma potansiyele sahiptir. Bu çalışmaların tamamı ülkemizde protein tabanlı biyomalzemelerin oluşturulması ve geliştirilmesi bakımından kritik öneme sahip olacaklardır. Oluşturulacak olan otonom hücre katma değeri yüksek biyoteknoloji ürün üretimine gidebilecek ürünlerin ortaya koyacak ve senterik biyoloji alanında ülkemize yeni yaklaşımların kazandırılmasını sağlayacaktır.