CRISPR/dCas9-Temelli Transkripsiyon Faktörü Tasarımları ile Sentetik Kontrollü Rekombinant Protein Üretim Sistemi İçin Yeni Nesil Pichia Pastoris Konakçı Geliştirilmesi

TÜBİTAK - AB COST Projesi , 2023 - 2027

Proje Türü: TÜBİTAK - AB COST Projesi
Başlama Tarihi: Nisan 2023
Bitiş Tarihi: Nisan 2027

Proje Özeti

Biyoürün endüstrisi için verimli ve kontrol edilebilen ekspresyon sistemleri elzemdir. Rekombinant protein üretiminde hızlı çoğalabilme, genetik olarak kolay manipüle edilebilme, ve post-translayonel modifikasyonları gerçekleştirebilme kabiliyetlerinden dolayı en çok tercih edilen ökaryotik konakçı organizma mayadır. Ancak, limitli üretim kapasiteleri ve karmaşık transkripsiyonel regülasyon mekanizmaları mayaların endüstriyel uygulamalarını kısıtlamaktadır. Günümüzde Pichia pastoris, akademi ve endüstride rekombinant protein üretiminde en yaygın kullanılan maya hücresidir; ve 5000?den fazla protein molekülü metilotrofik P. pastoris ile üretilmiştir. Ancak Escherichia coli bakterisi veya Saccharomyces cerevisiae mayası gibi model organizma olmadığı için, P. pastoris`in gen ekspresyon mekanizmaları ve kontrolü konusunda araştırmalar ve geliştirilen genetik araçlar hala kısıtlıdır. Bu durum biyofarmasötik endüstrisi için büyük potansiyeli olan P. pastoris?in toksik metanol kullanımına dayalı proseslerinin devam ettirilmesini gerektirmekte ve ürünlerinin yaygınlaşmasının önünde engel teşkil etmektedir. Söz konusu sorunları çözmek için projemiz kapsamında P. pastoris ile rekombinant protein üretimi için kontrol edilebilir, ortogonal, sentetik regülasyon devreleri oluşturulması için CRISPR/dCas9 sistemine dayalı sentetik transkripsiyon aktivatörleri (CRISPRa) ve baskılayıcıları (CRISPR/i) geliştirilmesi, ve P. pastoris?de CRISPRa/i sistemi ile transkripsiyon devrelerini yeniden tasarlayarak yeni nesil rekombinant protein üretim sistemi geliştirilmesi amaçlanmaktadır.

Projemizin özgün değerleri, yaşayan hücrelerde yeni gen devreleri tasarımı veya endojen kontrol devrelerinin yeniden yapılandırılması için spesifik genomik lokuslara hedeflenerek gen ekspresyonunu regüle edecek, farklı efektörlerin (p65AD, RTA, VP64, VPR aktivatörleri, ve KRAB, LUG, TPL, ve Mxi1 baskılayıcıları) kullanıldığı farklı güçlerde dinamik aralığa sahip, programlanabilen ve çok yönlü CRISPR-temelli transkripsiyon faktörü (CRISPR-TF) kütüphanesinin P. pastoris?de geliştirilmesidir. CRISPR-TF?ler hedef genlere homolog tasarlanacak spesifik gRNA?ler ile farklı lokuslara ve regüle edici bölgelere yeniden hedeflenebilir ve kolayca yeni durumlara uyarlanabilir olacaktır. P. pastoris?in en yaygın kullanılan konstitütif promotoru PGAP?in ortogonal regülasyonu için sentetik Psyn-GAP promotoru tasarlanacak; eGFP ve trastuzumab üretiminde kullanılacaktır. CRISPR-TF?ler geliştirilirken, gRNA ile MS2 ve Com aptamerleri birleştirilerek scRNA oluşturulacaktır. Hedeflene promotor gen bölgelerine spesifik tasarlanmış scRNA üzerinde dCas9 ve MCP/COM ile füzyonu gerçekleştirilmiş efektör moleküller yönlendirilerek P. pastoris?de ortogonal çift yönlü (eş zamanlı aktivasyon ve baskılanma) transkripsiyonel regülasyon ilk kez gerçekleştirilecek ve P. pastoris metabolizmasının yeniden düzenlenmesinde ve rekombinant antikor üretim sistemi geliştirilmesinde kullanılacaktır. CRISPRa/i sistemi ile P. pastoris?de gen ekspresyonunun ortogonal kontrolü sağlanacak, böylece rekombinant protein ekspresyonunun indüklenmesi sırasında hücre-içi metabolizmayı etkilemeden sadece hedef genin ekspresyon kontrolü sağlanacaktır.

Projemiz CRISPR/Cas9 sistemi ile kontrol edilen verimli ve yenilikçi bir rekombinant protein üretim sistemi geliştirecek olmasıyla yaşam bilimleri ve biyoteknoloji alanlarında yetkinlik kazanılması, yüksek teknolojili terapötik ürün üretimi ve bu konuda ülkemizdeki araştırma kapasitesinin gelişimine katkı sağlamayı amaçlamaktadır ve biyoteknolojik ilaç ve aşı üretimine hızlıca adapte edilebilecek sistem geliştirilecektir. Projemiz biyoteknolojik ilaçlar gibi yüksek teknoloji gerektiren alanda Ar-Ge, üretim, ve nitelikli insan kaynağı yetiştirilmesi konularına hizmet ederek, 11. Kalkınma Planı (2019-2023), Kritik Teknolojiler ile ilgili 354, 355, 356, 357,ve İlaç ve Tıbbi Cihaz ile ilgili 364 numaralı amaç ve politikalar ile örtüşerek sosyo-ekonomik kalkınmayı desteklemeyi hedeflemektedir.