Metabolik mühendislik ve reaksiyon mühendisliği prensipleriyle insan büyüme hormonu üretimi için yeni biyoteknolojik proses geliştirilmesi

Çalık P. (Yürütücü)

TÜBİTAK Projesi, 2015 - 2018

Proje Türü: TÜBİTAK Projesi
Başlama Tarihi: Mayıs 2015
Bitiş Tarihi: Mayıs 2018

Proje Özeti

İnsan büyüme hormonu (hGH), 22 kDa molekül ağırlığında, 191 amino asitten oluşan, beynin ön lobundaki hipofiz bezi tarafından üretilen bir proteindir. Hipofiz bezlerindeki somatotropik hücreler tarafından doğal olarak sentezlenen, kanda bulunan hGH’nin, insan organizmasında eksik, bozuk (defective) üretiminin neden olduğu problemlerin düzeltilmesi için dışarıdan verilme ihtiyacı –diğer hormonlar gibi- bu farmasötik temel maddenin biyoteknolojik prosesle endüstriyel üretimini önemli yapmaktadır. Bu proje kapsamında, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz başlatıcısının (promotör) (P_GAP) üzerinde bulunan transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgelerini transkripsiyon mühendisliği ile modifiye ederek rekombinant protein (r-protein) üretimini artırmak hedeflenmiştir. Pichia pastoris’te en çok kullanılan başlatıcılardan biri olan P_GAP, olası transkripsiyon faktörlerinin (TF) bağlanma bölgeleri açısından analiz edilmiştir. Bulunan TF bağlanma bölgeleri silinerek ya da doğal konumlarında duplike edilerek P_GAP varyant kütüphanesi oluşturulmuştur. Aynı zamanda, seçilen TF’ler aşırı-ekspres edilerek ya da silinerek, bu faktörlerin r-protein üretimine etkisi araştırılmıştır. Geliştirilen P_GAP varyantları altında modifiye yeşil floresan proteini üretiminin ekspresyon seviyeleri, doğal P_GAP’a kıyasla 0.35-3.10 kat arasında değişim göstermiştir. En yüksek ekspresyon seviyelerine ulaşan başlatıcı varyantları olan Pro9 (Gal4-benzeri TF bağlanma bölgesinin duplike edildiği) ve Pro10 (Rfx1 bağlanma bölgesinin silindiği) kontrolü altında ikinci model protein, rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH), ekspres edilmiş; doğal P_GAP’a kıyasla, sırasıyla, 2.4 ila 1.6 kat daha fazla rhGH üretilmiştir. Yarı-kesikli biyoreaktör işletim koşullarında, Pro9 kontrolü altında ve Gal4-benzeri TF’nin aşırı-ekspres edildiği suş ile rhGH üretiminde birim hücre başına 2.2 kat artış elde edilmiştir. Geliştirilen hibrit yarı-kesikli işletim ile en yüksek rhGH derişimi t = 8 st’te, C_rhGH = 611 mg dm^-3elde edilmiştir.