Persil Çetinkol Ö. (Yürütücü)
TÜBİTAK Projesi, 2017 - 2020
Proje Özeti Bu projenin en temel amacı üçlü sarmal DNA
yapılarına kuvvetli bir şekilde bağlanan ilaç adayı yeni molekülleri ortaya
çıkartmaktır. Proje kapsamındaki
amaçlarımızdan ilki azasiyanin 3 (aza3) bileşiğinin üçlü sarmal yapıya sahip
nükleik asitler ile olan etkileşimlerini in-vitro çalışmaları ile incelemek,
karakterize etmek ve azasiyanin moleküllerinin in-vivo çalışmalarda üçlü
sarmal oluşturan GAA•TTC tekrar dizinini içeren maya hücrelerinde göstermiş
olduğu etkiye dayanak sağlamak ve açıklık getirmektir. Bir diğer temel
hedefimiz ise aza3 molekülünde modifikasyonlar yaparak, bu moleküllerin üçlü
sarmal yapılar ile etkileşimlerini inceleyerek molekül yapısının bağlanma
üzerindeki etkisini açığa çıkartmaktır. Öncelikli olarak benzimidazol
halkasında bulunan alkil grubunun bağlanma üzerindeki etkisini açığa
çıkartmak için aza3’de bulunan N-metil grubu yerine N-etil, N-propil ve N-izopropil
grubu içeren moleküllerin üçlü sarmal yapı oluşturan polyd(A)n•polyd(T)n•polyd(T)n
ile etkileşimleri incelenecektir. Ayrıca benzimidazol halkasında direkt –CF3
modifikasyonunu içeren aza3 türevleri de proje kapsamında çalışılacaktır. Son
olarak ise benzimidazol halkası yerine benzotiyazol halkasını içeren ve maya
hücrelerindeki etkileri çalışılan aza4 ve aza5’in de polyd(A)n•polyd(T)n•polyd(T)n
ile etkileşimleri incelenerek, her üç
molekülün üçlü sarmal yapılara olan bağlanma özellikleri maya hücrelerinde
göstermiş oldukları etki ile karşılaştırılacaktır. Üçlü DNA sarmal yapıları anti-gen ve anti-sense stratejilerinin
ortaya çıkması ile önem kazanmıştır. Örneğin, anti-gen stratejilerinde temel
hedef transkript olacak genin büyük oluğuna (major groove) üçüncü bir dizinin
bağlanması ile üçlü sarmal yapı oluşturularak, transkripte görev alan
proteinlerin, polimerazların vb. gene bağlanmalarını ve görevlerini yerine
getirmelerini engellemektir. Anti-gen stratejilerindeki en temel sorun,
oluşturulan üçlü sarmal yapıların yeterince sağlam olmaması ve üçüncü dizinin
kolaylıkla ikili sarmaldan ayrılmasıdır. Bu sorunun bir çözümü üçlü sarmal yapıların
sağlamlığını bu yapılara bağlanan küçük molekülleri kullanarak arttırmaktır.
Bu yüzden üçlü sarmal yapılara bağlanan terapötik küçük moleküllerin (ilaçların)
tasarımı ve sentezi son yıllarda önem kazanmıştır. Diğer taraftan, üçlü sarmal yapıların in-vivo’da
oluştukları bilinmektedir. Örneğin, Friedreich’s Ataxia gibi genetik
nörodejeneratif hastalıklarda (GAA)n•(TTC)n gibi tekrar
dizinlerinin oluşturduğu üçlü sarmal yapıların rol aldığı bilinmektedir.
Normal insanlarda 6-34 arasında olan tekrar dizinin hasta kişilerde 66-1700
arasında olduğu gözlemlenmiştir. FXN genindeki bu mutasyonlar ise mitokondri
proteini frataxin’in daha düşük seviyede sentezlenmesine ve hücre
metabolizmasının bozulmasına sebep olmaktadır. Friedreich’s Ataxia hastalığı
yetim hastalıklar grubundadır ve ne yazık ki tedavisi için FDA tarafından
onaylanmış bir ilaç bulunmamaktadır. Friedreich’s Ataxia’ya endike ilaç
geliştirme çalışmalarının kullandığı stratejilerden biri in-vivo’da GAA•TTC
üçlü dizinlerinin oluşumunu engelleyerek, frataxin sentezini
arttırmaktır. Doktora çalışmalarım esnasında benzimidazol halka
yapsına sahip aza3 ve benzitiyazol halka yapısına sahip aza4 ve aza5
moleküllerinin, yapı olarak ikili sarmal DNA’ya interkalasyon ile bağlanmak
için büyük fakat pürin bazlarından oluşan daha geniş kanonik olmayan nükleik
asit yapıları için ise ideal moleküller olduğu keşfettik. Bu moleküllerin pürin
bazlarından oluşan polyr(A) ve G-dörtlü sarmal yapılarına kuvvetli bir
şekilde bağlandığını gözlemledik. İn-vitro’da yürütülen bu çalışmalardan yola
çıkarak Prof. Dr. Lobachev’in grubu ile maya hücrelerinde yürütülen
çalışmalarda ise aza3, aza4 ve aza5 moleküllerinin GAA•TTC tekrar dizinin
içeren maya hücrelerinde DNA sentezini bloke ettiğini, kromozomlarda
kırılganlığa sebep olduğunu ve hücre büyümesini engellediğini gözlemledik. Etkisinin
kullanılan doza bağlı olması, aza3 ve benzeri moleküllerin üçlü sarmal
nükleik asit yapılarına kuvvetli bir şekilde bağlanarak bu yapıları
sağlamlaştırdığını, bu moleküllerin anti-tümör ajanı veya floresans
özelliklerinden dolayı in-vivo’da üçlü sarmal yapıları belirleyici ajanlar
olarak kullanılabilecekleri fikrini doğurdu. Fakat ne yazık ki bu güne kadar
aza3 ve benzeri moleküllerin üçlü sarmal nükleik asitler ile etkileşimleri
incelenmemiş ve karakterize edilmemiştir. Bu kapsamda aza3 ve benzeri
moleküllerin üçlü sarmal yapıları sağlamlaştırdığının, bu yapılara ne şekilde
ve hangi koşullar altında bağlandığının ve seçiciliğinin ortaya çıkartıldığı
çalışmalara gereksinim duyulmaktadır. Bu proje kapsamında öncelikli olarak rekabetçi
diyaliz (competition dialysis) yöntemi kullanılarak aza3 molekülünün farklı
nükleik asit dizinleri ve yapılarına (tekli sarmal, ikili sarmal, üçlü sarmal
vb.) karşı seçiciliği ortaya çıkartılacaktır. Aza3 molekülünün UV-vis ve CD
spektroskopisi kullanılarak d(A)32•d(T)32•d(T)32,
polyd(A)n•polyd(T)n•polyd(T)n ve GAA
tekrarları içeren üçlü sarmal yapıya sahip DTR1 nükleik asit dizini ile
etkileşimleri incelenerek, bu etkileşimler ikili sarmal yapıya sahip d(A)32•d(T)32,
polyd(A)n•polyd(T)n ve GAA tekrarı içeren DD1
etkileşimleri ile karşılaştırılacaktır. Bu nükleik asit yapılarının aza3
tarafından daha stabil hale getirilip getirilmedikleri termal denatürasyon
deneyleri ile belirlenecektir. polyd(A)n•polyd(T)n•polyd(T)n
belirleyici yapı olarak ele alınacak ve aza3’ün bu üçlü sarmala hangi
koşullar altında (pH, tuz, vb.) bağlandığı ve bağlanma oranı Job Plot analizi
ile belirlenecektir. Termal denatürasyon deneyleri ile ayrıca aza3’
molekülünün, daha önceki çalışmalar sonucunda ortaya çıkarılan coralyne gibi polyd(A)•polyd(T) ikili sarmal yapılarını bozarak, bu yapıların
üçlü sarmal oluşturmasını sağlayıp sağlamadığı incelenecektir. Zira maya
hücrelerinde yürütülen çalışmalarda üçlü sarmal dizinlerine kuvvetli ve
seçici bir şekilde bağlandığı bilinen coralyne molekülü hiçbir etki
göstermemiştir. Ayrıca üçü ilk defa bu proje kapsamında
sentezlenecek olan 6 aza3 türevi molekülün de polyd(A)n•polyd(T)n•polyd(T)n
ile olan etkileşimleri incelenecektir.
Bu kapsamda floresans spektroskopisi kullanılarak tüm moleküllerin polyd(A)n•polyd(T)n•polyd(T)n
üçlü sarmalı ile bağlanma katsayıları
ve viskozimetre deneyleri kullanılarak tüm moleküllerin üçlü sarmal yapılara
interkalasyon yolu ile bağlanıp bağlanmadıkları belirlenecektir. Aza3 gibi bu
moleküllerin de seçicilikleri rekabetçi diyaliz yöntemi ile açığa
çıkartılacaktır. Bu proje ile
aza3 ve benzeri moleküllerin üçlü ve ikili sarmal nükleik asit yapılarına
bağlanmasını inceleyerek in-vivo çalışmalarının desteklenmesi, bu moleküllerin
üçlü sarmal yapılara bağlanmaları ile maya hücrelerinde göstermiş oldukları
etkilerinin arasındaki ilişkinin ve bu moleküllerin seçiciliklerinin ortaya
çıkartılması, molekül yapsının bağlanma üzerindeki etkisinin anlaşılması
kısacası bu moleküllerin anti-tümör ajan olma potansiyellerinin ortaya
çıkartılması amaçlanmaktadır. Bu projenin olumlu sonuçlanması, alkil
gruplarının bağlanma üzerindeki etkisinin anlaşılması daha etkili
moleküllerin tasarımının ve sentezinin önünün açılmasına ve ülkemizin 2023 vizyonunda
yer alan inovatif yerli ilaç projesine katkıda bulunulmasına sebep olacaktır.
Bu proje çıktılarının yüksek bilimsel etkiye sahip olan Journal of the
American Chemical Society, Nucleic Acids Research veya Biochemistry gibi
dergilerde yayınlanması ve ülkemizin bilimsel gelişimine katkı sağlaması da hedeflenmektedir.
Proje çıktıları Ulusal İlaç Kimyası Kongresi’nde Türk Bilim İnsanları ile de
paylaşılacaktır. |