Proje Özeti

Bu projenin en temel amacı üçlü sarmal DNA yapılarına kuvvetli bir şekilde bağlanan ilaç adayı yeni molekülleri ortaya çıkartmaktır.  Proje kapsamındaki amaçlarımızdan ilki azasiyanin 3 (aza3) bileşiğinin üçlü sarmal yapıya sahip nükleik asitler ile olan etkileşimlerini in-vitro çalışmaları ile incelemek, karakterize etmek ve azasiyanin moleküllerinin in-vivo çalışmalarda üçlü sarmal oluşturan GAA•TTC tekrar dizinini içeren maya hücrelerinde göstermiş olduğu etkiye dayanak sağlamak ve açıklık getirmektir. Bir diğer temel hedefimiz ise aza3 molekülünde modifikasyonlar yaparak, bu moleküllerin üçlü sarmal yapılar ile etkileşimlerini inceleyerek molekül yapısının bağlanma üzerindeki etkisini açığa çıkartmaktır. Öncelikli olarak benzimidazol halkasında bulunan alkil grubunun bağlanma üzerindeki etkisini açığa çıkartmak için aza3’de bulunan N-metil grubu yerine N-etil, N-propil ve N-izopropil grubu içeren moleküllerin üçlü sarmal yapı oluşturan polyd(A)_n•polyd(T)_n•polyd(T)_n ile etkileşimleri incelenecektir. Ayrıca  benzimidazol halkasında direkt –CF₃ modifikasyonunu içeren aza3 türevleri de proje kapsamında çalışılacaktır. Son olarak ise benzimidazol halkası yerine benzotiyazol halkasını içeren ve maya hücrelerindeki etkileri çalışılan aza4 ve aza5’in de polyd(A)_n•polyd(T)_n•polyd(T)_n ile etkileşimleri incelenerek, her üç molekülün üçlü sarmal yapılara olan bağlanma özellikleri maya hücrelerinde göstermiş oldukları etki ile karşılaştırılacaktır.

Üçlü DNA sarmal yapıları anti-gen ve anti-sense stratejilerinin ortaya çıkması ile önem kazanmıştır. Örneğin, anti-gen stratejilerinde temel hedef transkript olacak genin büyük oluğuna (major groove) üçüncü bir dizinin bağlanması ile üçlü sarmal yapı oluşturularak, transkripte görev alan proteinlerin, polimerazların vb. gene bağlanmalarını ve görevlerini yerine getirmelerini engellemektir. Anti-gen stratejilerindeki en temel sorun, oluşturulan üçlü sarmal yapıların yeterince sağlam olmaması ve üçüncü dizinin kolaylıkla ikili sarmaldan ayrılmasıdır. Bu sorunun bir çözümü üçlü sarmal yapıların sağlamlığını bu yapılara bağlanan küçük molekülleri kullanarak arttırmaktır. Bu yüzden üçlü sarmal yapılara bağlanan terapötik küçük moleküllerin (ilaçların) tasarımı ve sentezi son yıllarda önem kazanmıştır. 

Diğer taraftan, üçlü sarmal yapıların in-vivo’da oluştukları bilinmektedir. Örneğin, Friedreich’s Ataxia gibi genetik nörodejeneratif hastalıklarda (GAA)_n•(TTC)_n gibi tekrar dizinlerinin oluşturduğu üçlü sarmal yapıların rol aldığı bilinmektedir. Normal insanlarda 6-34 arasında olan tekrar dizinin hasta kişilerde 66-1700 arasında olduğu gözlemlenmiştir. FXN genindeki bu mutasyonlar ise mitokondri proteini frataxin’in daha düşük seviyede sentezlenmesine ve hücre metabolizmasının bozulmasına sebep olmaktadır. Friedreich’s Ataxia hastalığı yetim hastalıklar grubundadır ve ne yazık ki tedavisi için FDA tarafından onaylanmış bir ilaç bulunmamaktadır. Friedreich’s Ataxia’ya endike ilaç geliştirme çalışmalarının kullandığı stratejilerden biri in-vivo’da GAA•TTC üçlü dizinlerinin oluşumunu engelleyerek, frataxin sentezini arttırmaktır. 

Doktora çalışmalarım esnasında benzimidazol halka yapsına sahip aza3 ve benzitiyazol halka yapısına sahip aza4 ve aza5 moleküllerinin, yapı olarak ikili sarmal DNA’ya interkalasyon ile bağlanmak için büyük fakat pürin bazlarından oluşan daha geniş kanonik olmayan nükleik asit yapıları için ise ideal moleküller olduğu keşfettik. Bu moleküllerin pürin bazlarından oluşan polyr(A) ve G-dörtlü sarmal yapılarına kuvvetli bir şekilde bağlandığını gözlemledik. İn-vitro’da yürütülen bu çalışmalardan yola çıkarak Prof. Dr. Lobachev’in grubu ile maya hücrelerinde yürütülen çalışmalarda ise aza3, aza4 ve aza5 moleküllerinin GAA•TTC tekrar dizinin içeren maya hücrelerinde DNA sentezini bloke ettiğini, kromozomlarda kırılganlığa sebep olduğunu ve hücre büyümesini engellediğini gözlemledik. Etkisinin kullanılan doza bağlı olması, aza3 ve benzeri moleküllerin üçlü sarmal nükleik asit yapılarına kuvvetli bir şekilde bağlanarak bu yapıları sağlamlaştırdığını, bu moleküllerin anti-tümör ajanı veya floresans özelliklerinden dolayı in-vivo’da üçlü sarmal yapıları belirleyici ajanlar olarak kullanılabilecekleri fikrini doğurdu. Fakat ne yazık ki bu güne kadar aza3 ve benzeri moleküllerin üçlü sarmal nükleik asitler ile etkileşimleri incelenmemiş ve karakterize edilmemiştir. Bu kapsamda aza3 ve benzeri moleküllerin üçlü sarmal yapıları sağlamlaştırdığının, bu yapılara ne şekilde ve hangi koşullar altında bağlandığının ve seçiciliğinin ortaya çıkartıldığı çalışmalara gereksinim duyulmaktadır.

Bu proje kapsamında öncelikli olarak rekabetçi diyaliz (competition dialysis) yöntemi kullanılarak aza3 molekülünün farklı nükleik asit dizinleri ve yapılarına (tekli sarmal, ikili sarmal, üçlü sarmal vb.) karşı seçiciliği ortaya çıkartılacaktır. Aza3 molekülünün UV-vis ve CD spektroskopisi kullanılarak d(A)₃₂•d(T)₃₂•d(T)₃₂, polyd(A)_n•polyd(T)_n•polyd(T)_n ve GAA tekrarları içeren üçlü sarmal yapıya sahip DTR1 nükleik asit dizini ile etkileşimleri incelenerek, bu etkileşimler ikili sarmal yapıya sahip d(A)₃₂•d(T)₃₂, polyd(A)_n•polyd(T)_n ve GAA tekrarı içeren DD1 etkileşimleri ile karşılaştırılacaktır. Bu nükleik asit yapılarının aza3 tarafından daha stabil hale getirilip getirilmedikleri termal denatürasyon deneyleri ile belirlenecektir. polyd(A)_n•polyd(T)_n•polyd(T)_n belirleyici yapı olarak ele alınacak ve aza3’ün bu üçlü sarmala hangi koşullar altında (pH, tuz, vb.) bağlandığı ve bağlanma oranı Job Plot analizi ile belirlenecektir. Termal denatürasyon deneyleri ile ayrıca aza3’ molekülünün, daha önceki çalışmalar sonucunda ortaya çıkarılan coralyne gibi polyd(A)•polyd(T) ikili sarmal yapılarını bozarak, bu yapıların üçlü sarmal oluşturmasını sağlayıp sağlamadığı incelenecektir. Zira maya hücrelerinde yürütülen çalışmalarda üçlü sarmal dizinlerine kuvvetli ve seçici bir şekilde bağlandığı bilinen coralyne molekülü hiçbir etki göstermemiştir.

Ayrıca üçü ilk defa bu proje kapsamında sentezlenecek olan 6 aza3 türevi molekülün de polyd(A)_n•polyd(T)_n•polyd(T)_n ile olan etkileşimleri incelenecektir. Bu kapsamda floresans spektroskopisi kullanılarak tüm moleküllerin polyd(A)_n•polyd(T)_n•polyd(T)_n üçlü sarmalı ile bağlanma katsayıları ve viskozimetre deneyleri kullanılarak tüm moleküllerin üçlü sarmal yapılara interkalasyon yolu ile bağlanıp bağlanmadıkları belirlenecektir. Aza3 gibi bu moleküllerin de seçicilikleri rekabetçi diyaliz yöntemi ile açığa çıkartılacaktır.

Bu proje ile aza3 ve benzeri moleküllerin üçlü ve ikili sarmal nükleik asit yapılarına bağlanmasını inceleyerek in-vivo çalışmalarının desteklenmesi, bu moleküllerin üçlü sarmal yapılara bağlanmaları ile maya hücrelerinde göstermiş oldukları etkilerinin arasındaki ilişkinin ve bu moleküllerin seçiciliklerinin ortaya çıkartılması, molekül yapsının bağlanma üzerindeki etkisinin anlaşılması kısacası bu moleküllerin anti-tümör ajan olma potansiyellerinin ortaya çıkartılması amaçlanmaktadır. Bu projenin olumlu sonuçlanması, alkil gruplarının bağlanma üzerindeki etkisinin anlaşılması daha etkili moleküllerin tasarımının ve sentezinin önünün açılmasına ve ülkemizin 2023 vizyonunda yer alan inovatif yerli ilaç projesine katkıda bulunulmasına sebep olacaktır. Bu proje çıktılarının yüksek bilimsel etkiye sahip olan Journal of the American Chemical Society, Nucleic Acids Research veya Biochemistry gibi dergilerde yayınlanması ve ülkemizin bilimsel gelişimine katkı sağlaması da hedeflenmektedir. Proje çıktıları Ulusal İlaç Kimyası Kongresi’nde Türk Bilim İnsanları ile de paylaşılacaktır.