A Brighter Method to Illuminate the Dark Side of Adhesion G Protein-Coupled Receptors: Detection of the ADGRG1 Dimers by Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)


Thesis Type: Postgraduate

Institution Of The Thesis: Middle East Technical University, Faculty of Arts and Sciences, Department of Biology, Turkey

Approval Date: 2021

Thesis Language: English

Student: MERVE MURAT

Principal Consultant (For Co-Consultant Theses): Çağdaş Devrim Son

Co-Consultant: Orkun Cevheroğlu

Abstract:

G proteine kenetli reseptörler (GPKR), canlı hücrelerde oligomerik yapılar oluşturur ve bu kompleks yapılar reseptörün matürasyonu, trafiği ve sinyalizasyon mekanizmalarını etkiler. GPKR’lerin en büyük ikinci alt-ailesi olan adezyon G proteine kenetli reseptörler de (aGPKR), hücreler arası matriks ve komşu hücre yüzeyinde bulunan ligandlarla doku ve organ gelişimine etki etmek için etkileşime girerler. Fakat, aGPKR’lerin birbirleri ile etkileşime girip girmediği hala belirsizdir. Bu çalışmada, aGPKR’lerin dimerizasyonun canlı hücrelerde Biyolüminesan Rezonans Enerji Transferi (BRET) ile araştırılması için model bir aGPKR olan ADGRG1 kullanılmıştır. BRET donörü (NLuc) ya da akseptörü (EGFP) ile C-terminalindeki çeşitli pozisyonlardan işaretlenmiş ADGRG1 reseptörlerinin HEK 293 hücrelerinde ifade edilmesi sağlanmıştır. İşaretli reseptörlerin hücre içi lokalizasyonları lazer taramalı konfokal mikroskop ile doğrulanmıştır. C-terminalinden işaretli konstraktların hücre içi ifadeleri Western blotlama yöntemi ile belirlenmiş ve konstraktların işlevselliği biyolüminesans temelli Serum Response Element (SRE) Assay ile belirlenmiştir. EGFP ile işaretli bütün ADGRG1 konstraktlarının, WT ve N-terminalinden kesilmiş reseptörlerde olduğu gibi fonksiyonel oldukları gösterilmiştir. NanoLuc (NLuc) ve Renilla luciferase (RLuc)’in ikisi de coelenterazine’i okside ettikleri için, NLuc işaretli ADGRG1 reseptörleri SRE yöntemi ile test edilememiş ancak işaretlemeler aynı bölgeden yapıldığı için daha küçük bir tag olan NLuc ile işaretli reseptörler de fonksiyonel olarak sayılmıştır. ADGRG1 reseptörünün in vivo dimerizasyonunun saptanması için NLuc ile işaretli ADGRG1 konstraktları, EGFP ile işaretli ADGRG1 konstraktları ile birlikte transfekte edilmişlerdir. Etkileşime giren reseptörlerden dolayı meydana gelen BRET ölçülmüştür. C-terminalinden işaretli reseptörler ile karşılaştırıldığında, C-terminalindeki 667’inci amino asiti ardından işaretlenmiş ADGRG1 reseptörlerinde BRET artmıştır. Bu çalışmada belirtilen sonuçlar, aGPKR’lerden biri olan ADGRG1’ın homodimerizasyonuna hatta oligomerizasyonuna ilişkin ilk kez bilgi sağlamaktadır.