Research Information System
Thesis Type: Postgraduate
Institution Of The Thesis: Middle East Technical University, Graduate School of Natural and Applied Sciences, Graduate School of Natural and Applied Sciences, Turkey
Approval Date: 2021
Thesis Language: English
Student: NİLÜFER KARA
Principal Consultant (For Co-Consultant Theses): Çağdaş Devrim Son
Co-Consultant: Müslüm İlgü
Abstract:
Membran Proteinlerinin (MP) hedef molekülü olarak kullanımı, sahip oldukları
amfipatik doğaları nedeniyle zorluk gösterir. MP’lerin çift katlı lipit tabakasında
bulunan hidrofilik ve hidrofobik kısımları, MP’lere karakteristik işlevlerini
kazandırır. Bu sebeple, in vitro çalışmalar, MP’lerin doğru bir şekilde işlevlerini
yerine getirebilmeleri için protein katlanmasını sağlamak adına doğal çevrelerini
taklit edebilecek bir ortama gereksinim duyarlar. Bu noktada, deterjan ile muamele
MP’lerinin işlevlerini yitirmeden çözünmesi ve stabil bir protein olarak kalması
açısından çok önemlidir. Biz çalışmalarımızda, aptamer seçilimi için, Escherichia
Coli’nin iç membranında yer alıp, ikincil bir antiport olan ve aynı zamanda asidik
stres adaptasyonunda önemli rol oynayan Kadaverin/Lösin Antiportu (CadB)
proteinini hedef molekülü olarak kullandık.
Aptamerler, in vitro olarak seçilen DNA ya da RNA oligonükleotitlerinden oluşan
kısa nükleik asit zincirleridir. Aptamerlerin seçilimi, Üstel Zenginleştirme ile
Ligandların Sistematik Evrimi (SELEX) yöntemi ile gerçekleştirilir. Bu süreç,
yüksek afinite ve seçilimle hedef molekülüne bağlanan aptamer/leri seçmek için
tekrarlayan turlarla oluşmakta olup üç ana adımda bir tur tamamlanmaktadır: hedef
molekülü ile inkübasyon, oligo-bağlı protein yapılarının ayrılması, oligo çoğaltma.
Hedef molekülü ile etkileşim, aptamerin yapısında konformasyonel bir değişiklik
meydana getirir. Aptamer geliştirildikten sonra, bu etkileşim, ileriki çalışmalarda
tedavi ve teşhis alanlarında potansiyel kullanıma sahiptir. Şimdiye dek, aptamer
seçiliminde pek çok SELEX tekniği kullanılmıştır. Fakat bunlardan bazıları iş gücü
gerektiren, zaman alıcı ve MP’lere karşı özgüllüğü düşük olan yöntemlerdir.
Bu projede, seçilimi gerçekleştirmeden önce, CadB’nin çözünürlüğünü ve
saflaştırılmasını hafif bir deterjan olan n-dodesil-β-D-maltopiranosit (DDM)’te
gerçekleştirdik. Son tur tamamlandıktan sonra, RNA havuzu sekanslaması yapıldı
ve son olarak 29 farklı sekans elde ettik. En çok tekrarlanan sekansları (iki kez
tekrarlanmış şekilde) belirledik: CadB30, CadB35 ve CadB39. Sonrasında, çoklu
sekans hizalama analizi ile potansiyel bağlanma motifini bulduk. Sonra, tahmini
ikincil yapılara (RNAfold ve KineFold tarafından yapıldı) göre, bu motif CadB35
ve CadB39’un ilmik (loop) yapısında bulunurken, CadB30’un sap (stem) yapısında
bulundu. Ayrıca, biz bunların yapısal benzerliklerini homoloji matriksleriyle
göstermek için, CadB30 ve CadB39’a yakın olacak şekilde rastgele bir protoaptamer
(CadB41) seçtik.
Biz bu çalışmada, sekiz tur protein-SELEX’inden sonra CadB’ye karşı aptamerleri
başarıyla elde ettik. Bu çalışma, CadB bir MP olarak, uygun bir deterjanda protein-
SELEX ile hedef molekülü olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu şekilde,
yakın gelecekte teşhis ve tedavi amaçlarında, MP’lerin hedef molekülü olarak
kullanımı daha elverişli hale gelecektir. Protein-SELEX, bütün proteinler için
uygun olduğundan daha basit, zaman kazandıran, uygun maliyetli aptamer seçilimi
sağlar.