Aptamer selection against cadaverine/lysine antiporter (CADB) purified in mild detergent


Thesis Type: Postgraduate

Institution Of The Thesis: Middle East Technical University, Graduate School of Natural and Applied Sciences, Graduate School of Natural and Applied Sciences, Turkey

Approval Date: 2021

Thesis Language: English

Student: NİLÜFER KARA

Principal Consultant (For Co-Consultant Theses): Çağdaş Devrim Son

Co-Consultant: Müslüm İlgü

Abstract:

Membran Proteinlerinin (MP) hedef molekülü olarak kullanımı, sahip oldukları

amfipatik doğaları nedeniyle zorluk gösterir. MP’lerin çift katlı lipit tabakasında

bulunan hidrofilik ve hidrofobik kısımları, MP’lere karakteristik işlevlerini

kazandırır. Bu sebeple, in vitro çalışmalar, MP’lerin doğru bir şekilde işlevlerini

yerine getirebilmeleri için protein katlanmasını sağlamak adına doğal çevrelerini

taklit edebilecek bir ortama gereksinim duyarlar. Bu noktada, deterjan ile muamele

MP’lerinin işlevlerini yitirmeden çözünmesi ve stabil bir protein olarak kalması

açısından çok önemlidir. Biz çalışmalarımızda, aptamer seçilimi için, Escherichia

Coli’nin iç membranında yer alıp, ikincil bir antiport olan ve aynı zamanda asidik

stres adaptasyonunda önemli rol oynayan Kadaverin/Lösin Antiportu (CadB)

proteinini hedef molekülü olarak kullandık.

Aptamerler, in vitro olarak seçilen DNA ya da RNA oligonükleotitlerinden oluşan

kısa nükleik asit zincirleridir. Aptamerlerin seçilimi, Üstel Zenginleştirme ile

Ligandların Sistematik Evrimi (SELEX) yöntemi ile gerçekleştirilir. Bu süreç,

yüksek afinite ve seçilimle hedef molekülüne bağlanan aptamer/leri seçmek için

tekrarlayan turlarla oluşmakta olup üç ana adımda bir tur tamamlanmaktadır: hedef

molekülü ile inkübasyon, oligo-bağlı protein yapılarının ayrılması, oligo çoğaltma.

Hedef molekülü ile etkileşim, aptamerin yapısında konformasyonel bir değişiklik

meydana getirir. Aptamer geliştirildikten sonra, bu etkileşim, ileriki çalışmalarda

tedavi ve teşhis alanlarında potansiyel kullanıma sahiptir. Şimdiye dek, aptamer

seçiliminde pek çok SELEX tekniği kullanılmıştır. Fakat bunlardan bazıları iş gücü

gerektiren, zaman alıcı ve MP’lere karşı özgüllüğü düşük olan yöntemlerdir.

Bu projede, seçilimi gerçekleştirmeden önce, CadB’nin çözünürlüğünü ve

saflaştırılmasını hafif bir deterjan olan n-dodesil-β-D-maltopiranosit (DDM)’te

gerçekleştirdik. Son tur tamamlandıktan sonra, RNA havuzu sekanslaması yapıldı

ve son olarak 29 farklı sekans elde ettik. En çok tekrarlanan sekansları (iki kez

tekrarlanmış şekilde) belirledik: CadB30, CadB35 ve CadB39. Sonrasında, çoklu

sekans hizalama analizi ile potansiyel bağlanma motifini bulduk. Sonra, tahmini

ikincil yapılara (RNAfold ve KineFold tarafından yapıldı) göre, bu motif CadB35

ve CadB39’un ilmik (loop) yapısında bulunurken, CadB30’un sap (stem) yapısında

bulundu. Ayrıca, biz bunların yapısal benzerliklerini homoloji matriksleriyle

göstermek için, CadB30 ve CadB39’a yakın olacak şekilde rastgele bir protoaptamer

(CadB41) seçtik.

Biz bu çalışmada, sekiz tur protein-SELEX’inden sonra CadB’ye karşı aptamerleri

başarıyla elde ettik. Bu çalışma, CadB bir MP olarak, uygun bir deterjanda protein-

SELEX ile hedef molekülü olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu şekilde,

yakın gelecekte teşhis ve tedavi amaçlarında, MP’lerin hedef molekülü olarak

kullanımı daha elverişli hale gelecektir. Protein-SELEX, bütün proteinler için

uygun olduğundan daha basit, zaman kazandıran, uygun maliyetli aptamer seçilimi

sağlar.